對于許多免疫組織化學(xué)（IHC）應(yīng)用，傳統(tǒng)的酶擴(kuò)增程序足以實(shí)現(xiàn)足夠的抗原檢測。然而，有幾個因素限制了這些程序的敏感性和實(shí)用性。酪胺信號擴(kuò)增（TSA）已被證明是一種特別通用和強(qiáng)大的酶擴(kuò)增技術(shù)，具有提高的檢測靈敏度。TSA基于HRP在低濃度過氧化氫存在下將標(biāo)記的含酪胺底物轉(zhuǎn)化為氧化的高反應(yīng)性自由基的能力，該自由基可以共價(jià)結(jié)合HRP處或附近的酪氨酸殘基。為了實(shí)現(xiàn)最大的IHC檢測，酪胺用熒光團(tuán)預(yù)標(biāo)記。每個過氧化物酶標(biāo)記的多個酪胺底物的周轉(zhuǎn)所賦予的信號放大轉(zhuǎn)化為對低豐度靶標(biāo)的超靈敏檢測以及使用少量抗體和雜交探針。在免疫組織化學(xué)應(yīng)用中，TSA方法產(chǎn)生的靈敏度增強(qiáng)允許增加一次抗體稀釋液以減少非特異性背景信號，并可以克服由次優(yōu)固定程序或低水平靶表達(dá)引起的弱免疫標(biāo)記。Cy3-酪胺含有明亮的Cy3，可以用標(biāo)準(zhǔn)的Cy3過濾器組很容易地檢測到。

艾美捷Cy3酪胺(Cy3 tyramite)：

貨號：AAT-11065

單位尺寸：1毫克

分子量：863.96

H-phrase：H303, H313, H333

僅限研究使用（RUO）

R-phrase：R20, R21, R22

儲存：冷凍（< -15°C）；盡量減少光照

激發(fā)：Cy3, TRITC濾光片組

發(fā)射：Cy3, TRITC濾光片組

推薦板： 黑色壁，透明底部

母液的制備：

除非另有說明，所有未使用的母液應(yīng)在制備后分裝成單次使用的小份，并儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融。

酪胺母液（1000X）：加入適量的DMSO以制備1-5 mM的酪胺母液。

注意：制作單次使用的小份，并在2-8°C下避光儲存未使用的1000X母液。避免反復(fù)凍融。

工作溶液的制備：

酪胺工作溶液（1X）

在含有0.003% H2O2的您選擇的緩沖液中加入1 ?L的酪胺母液。

注意：為了最佳性能，請使用pH=7.4的Tris緩沖液。

注意：酪胺工作溶液應(yīng)立即使用，并在當(dāng)天新鮮制備。避免直接暴露于光線。

二抗-HRP工作溶液

根據(jù)制造商的建議，制備適當(dāng)濃度的二抗-HRP工作溶液。

樣品實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

此協(xié)議適用于細(xì)胞和組織的染色。

細(xì)胞固定和滲透

用3.7%甲醛或多聚甲醛在PBS中室溫固定細(xì)胞或組織20分鐘。

用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。

用0.1% Triton X-100溶液在室溫下滲透細(xì)胞1-5分鐘。

用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。

組織固定、脫蠟和再水化

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)IHC協(xié)議進(jìn)行組織的脫蠟和脫水。

過氧化物酶標(biāo)記：

可選：通過在過氧化物酶封閉溶液（如3%過氧化氫）中孵育細(xì)胞或組織樣本10分鐘來抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。用PBS在室溫下沖洗兩次。

可選：如果使用HRP共軛的鏈霉親和素，建議用生物素封閉緩沖液阻斷內(nèi)源性生物素。

用首選的封閉溶液（如含1% BSA的PBS）在4°C下封閉30分鐘。

移除封閉溶液，并加入推薦稀釋液中稀釋的一抗，在室溫下孵育60分鐘或在4°C下過夜。

用PBS沖洗三次，每次5分鐘。

向每個樣本施加100 ?L的二抗-HRP工作溶液，并在室溫下孵育60分鐘。

注意：孵育時間和濃度可根據(jù)信號強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)整。

用PBS沖洗三次，每次5分鐘。

酪胺標(biāo)記：

準(zhǔn)備并施加100 ?L的酪胺工作溶液到每個樣本，并在室溫下孵育5-10分鐘。

注意：如果觀察到非特異性信號，可以縮短與酪胺的孵育時間。您應(yīng)該使用不同孵育時間點(diǎn)的陽性和陰性對照樣本來優(yōu)化孵育期。或者您可以在工作溶液中使用更低濃度的酪胺。

用PBS沖洗三次。

對比染色和熒光成像

根據(jù)需要對細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行對比染色。AAT提供了一系列核對比染色試劑，如表1所列。請遵循試劑附帶的說明。

使用具有防褪色特性的封片介質(zhì)安裝蓋玻片。

注意：為確保最佳結(jié)果，建議使用ReadiUse?顯微鏡封片溶液（目錄號20009）或FluoroQuest? TSA/PSA防褪色封片介質(zhì)*優(yōu)化用于酪胺和丙烯酰胺成像*（目錄號44890）代替Vectashield?封片介質(zhì)。在某些情況下，Vectashield?封片介質(zhì)可能不適用于某些TSA/PSA綴合物。

使用適當(dāng)?shù)臑V光片組來觀察酪胺標(biāo)記的信號。

圖：石蠟包埋的人肺癌的免疫熒光圖像，用EpCAM兔單克隆抗體標(biāo)記，然后用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）標(biāo)記（Cat#16793）。該信號是用AAT的Cy3-酪胺（Cat#11065，紅色）產(chǎn)生的。細(xì)胞也用DAPI（藍(lán)色）復(fù)染。

Cy3酪胺(Cy3 tyramite)文獻(xiàn)參考：

Enhanced detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in fixed tissues by in situ hybridization following tyramide signal amplification

Authors: Trang NT, Hirai T, Ngan PH, Lan NT, Fuke N, Toyama K, Yamamoto T, Yamaguchi R.

Journal: J Vet Diagn Invest (2015): 326

Tyramide Signal Amplification for Immunofluorescent Enhancement

Authors: Faget L, Hnasko TS.

Journal: Methods Mol Biol (2015): 161

Rapid and sensitive detection of Escherichia coli O157:H7 in milk and ground beef using magnetic bead-based immunoassay coupled with tyramide signal amplification

Authors: Aydin M, Herzig GP, Jeong KC, Dunigan S, Shah P, Ahn S.

Journal: J Food Prot (2014): 100

Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis

Authors: Stack EC, Wang C, Roman KA, Hoyt CC.

Journal: Methods (2014): 46

KSHV cell attachment sites revealed by ultra sensitive tyramide signal amplification (TSA) localize to membrane microdomains that are up-regulated on mitotic cells

Authors: Garrigues HJ, Rubinchikova YE, Rose TM.

Journal: Virology (2014): 75