鈣測量對于許多生物學(xué)研究至關(guān)重要。結(jié)合Ca2+后顯示光譜響應(yīng)的熒光探針使研究人員能夠通過使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、熒光光譜和熒光微孔板讀數(shù)器來研究細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化。Fluo-3和Rhod-2是可見光興奮性鈣指示劑中最常用的。Fluo-3指示劑廣泛應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡。最近，F(xiàn)luo-3，AM已被廣泛用于基于細(xì)胞的高通量篩選試驗(yàn)，用于功能性GPCR試驗(yàn)。Fluo-3基本上是不熒光的，除非與Ca2+結(jié)合，并且在飽和Ca2+時(shí)的量子產(chǎn)率為~0.14，Ca2+的Kd為390 nM。

艾美捷鈣離子熒光探針Fluo-3,AM,超級(jí)純：

貨號(hào)：AAT-21011

單位尺寸：1毫克

解離常數(shù)（Kd，納摩爾）：390

分子量：1129.85

溶劑：DMSO

消光系數(shù)（厘米^-1 摩爾^-1）：86,0001

激發(fā)（納米）：506

發(fā)射（納米）：515

量子產(chǎn)率：0.151

僅限研究使用（RUO）

儲(chǔ)存：冷凍（< -15°C）；盡量減少光照

CAS：121714-22-5

激發(fā)：FITC

發(fā)射：FITC

推薦板：黑色壁，透明底部

激發(fā)：490

發(fā)射：525

截止：515

推薦板：黑色壁，透明底部

儀器規(guī)格：底部讀取模式，可編程液體處理

制備母液：除非另有說明，所有未使用的母液應(yīng)在制備后分裝成單次使用的小份，并儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融。

Fluo-3 AM 超純級(jí)別母液：在高質(zhì)量的無水DMSO中制備Fluo-3 AM的2至5 mM母液。

制備工作溶液：

Fluo-3 AM 超純級(jí)別工作溶液

在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Fluo-3 AM溶解在DMSO中，或?qū)⒅甘緞┠敢旱男》萁鈨鲋潦覝亍?/span>

在您選擇的緩沖液中（例如，Hanks和Hepes緩沖液）用0.04%的Pluronic? F-127制備2至20 ?M的Fluo-3 AM工作溶液。對于大多數(shù)細(xì)胞系，建議使用最終濃度為4-5 μM的Fluo-3 AM。細(xì)胞加載所需的指示劑的確切濃度必須通過實(shí)驗(yàn)確定。

注意：非離子洗滌劑Pluronic? F-127有時(shí)被用來增加Fluo-3 AM的水溶性。可以從AAT Bioquest購買各種Pluronic? F-127溶液。

注意：如果您的細(xì)胞包含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以在染料工作溶液中加入丙磺舒（1-2 mM）（最終濃度為0.5-1 mM），以減少脫酯化指示劑的泄漏。可以從AAT Bioquest購買各種ReadiUse?丙磺舒產(chǎn)品，包括水溶性、鈉鹽和穩(wěn)定溶液。

樣品實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

以下是AAT推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的協(xié)議。此協(xié)議僅提供指導(dǎo)，并應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

在生長介質(zhì)中準(zhǔn)備細(xì)胞過夜。

第二天，將1X Fluo-3 AM工作溶液添加到您的細(xì)胞板中。

注意：如果您的化合物與血清發(fā)生干擾，在染料加載前用新鮮的HHBS緩沖液替換生長介質(zhì)。

將染料加載的板在37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30至60分鐘。

注意：將染料孵育超過2小時(shí)可以提高某些細(xì)胞系的信號(hào)強(qiáng)度。

將染料工作溶液替換為HHBS或您選擇的緩沖液（如果適用，含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，如1 mM丙磺舒），以去除多余的探針。

根據(jù)需要添加刺激劑，并同時(shí)使用配備FITC濾光片組的熒光顯微鏡或包含可編程液體處理系統(tǒng)的熒光板讀取器（如FDSS、FLIPR或FlexStation）在490/525 nm截止515 nm處測量熒光。

鈣離子熒光探針Fluo-3,AM,超級(jí)純文獻(xiàn)參考：

A flow cytometric comparison of Indo-1 to fluo-3 and Fura Red excited with low power lasers for detecting Ca(2+) flux

Authors: Bailey S, Macardle PJ.

Journal: J Immunol Methods (2006): 220

Functional fluo-3/AM assay on P-glycoprotein transport activity in L1210/VCR cells by confocal microscopy

Authors: Orlicky J, Sulova Z, Dovinova I, Fiala R, Zahradnikova A, Jr., Breier A.

Journal: Gen Physiol Biophys (2004): 357

Comparison of human recombinant adenosine A2B receptor function assessed by Fluo-3-AM fluorometry and microphysiometry

Authors: Patel H, Porter RH, Palmer AM, Croucher MJ.

Journal: Br J Pharmacol (2003): 671

Measurement of the dissociation constant of Fluo-3 for Ca2+ in isolated rabbit cardiomyocytes using Ca2+ wave characteristics

Authors: Loughrey CM, MacEachern KE, Cooper J, Smith GL.

Journal: Cell Calcium (2003): 1

[Ca2+]i following extrasystoles in guinea-pig trabeculae microinjected with fluo-3 - a comparison with frog skeletal muscle fibres

Authors: Wohlfart B., undefined

Journal: Acta Physiol Scand (2000): 1