腺相關(guān)病毒（AAV）源自有缺陷的細(xì)小病毒，依賴其他病毒（如腺病毒和皰疹病毒）提供的必要輔助功能以實(shí)現(xiàn)高效的病毒復(fù)制和傳播。AAV與任何已知疾病均無病因?qū)W關(guān)聯(lián)，并已成功用于在多種組織中建立高效且長期的體內(nèi)基因表達(dá)，且未引起顯著的細(xì)胞免疫反應(yīng)或毒性。AAV具有單鏈DNA基因組，長度約為4.7 kb。所有已鑒定的AAV血清型均具有三個(gè)關(guān)鍵特征，包括兩份AAV末端重復(fù)序列（ITR）、一個(gè)rep區(qū)和一個(gè)cap區(qū)。

最近，通過全基因組篩選尋找AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的基因，發(fā)現(xiàn)I型跨膜蛋白KIAA0319L（現(xiàn)更名為AAV受體，AAVR）是多種AAV血清型進(jìn)入代表性細(xì)胞類型以及在小鼠體內(nèi)的關(guān)鍵受體（參考文獻(xiàn)4）。AAVR具有一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)短的C末端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，后者對于向反式高爾基網(wǎng)絡(luò)的逆向運(yùn)輸是必需的。其外域（與AAV衣殼結(jié)合）包含五個(gè)串聯(lián)的Ig樣多囊腎病（PKD）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)MANEC結(jié)構(gòu)域和一個(gè)N末端信號肽。

作為Cell Biolabs全國總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦Cell Biolabs熱銷產(chǎn)品pLenti-AAVR-Puro 載體。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

pLenti-AAVR-Puro 載體：

慢病毒生產(chǎn)

轉(zhuǎn)染前一天：將足夠數(shù)量的293T細(xì)胞或293LTV細(xì)胞（產(chǎn)品編號 LTV-100）鋪板，使其在轉(zhuǎn)染當(dāng)天達(dá)到70-80%的匯合度。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞：使用磷酸鈣或其他轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

注意：建議使用FuGENE?轉(zhuǎn)染試劑（Roche Applied Science）或Lipofectamine? Plus（Invitrogen）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。推薦質(zhì)粒比例為3:1:1:1（pLenti-AAVR-Puro：pCMV-VSV-G：pRSV-REV：pCgpV）。

收集慢病毒上清：轉(zhuǎn)染后36-72小時(shí)收集慢病毒上清。可在12小時(shí)間隔內(nèi)收集2次或3次。收集期間需保存于4°C。

處理上清：將收集的上清合并，以1500 rpm離心5分鐘去除細(xì)胞碎片，并通過0.22 ?m濾膜過濾。

保存上清：上清可直接使用，或根據(jù)需要進(jìn)行純化/濃縮。長期保存時(shí)，需將上清分裝后保存于-80°C。

包裝后注意事項(xiàng)

包裝慢病毒只是確保基因成功表達(dá)的第一步。在感染宿主細(xì)胞之前，需要考慮以下步驟：

慢病毒的濃縮與純化：由于慢病毒的潛伏特性，在感染宿主細(xì)胞之前，必須確保病毒高度濃縮。此外，病毒上清中的雜質(zhì)可能會降低感染效率。

測定慢病毒滴度：這是確保病毒能夠一致轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞的重要步驟。然而，qPCR或穩(wěn)定克隆計(jì)數(shù)可能需要1-2周時(shí)間。傳統(tǒng)的p24 ELISA試劑盒可能會大幅高估慢病毒滴度。我們的先進(jìn)p24 ELISA試劑盒QuickTiter?慢病毒滴度試劑盒（產(chǎn)品編號 VPK-107）采用獨(dú)家技術(shù)，可去除上清中的游離p24，從而提供更準(zhǔn)確的慢病毒滴度。結(jié)果可在6-18小時(shí)內(nèi)獲得。

使用轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑提高感染效率：許多細(xì)胞難以被慢病毒有效感染，而缺乏輔助試劑時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可能會很低。雖然Polybrene?等試劑可以提供幫助，但往往仍不足夠。Cell Biolabs的ViraDuctin?慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑盒（產(chǎn)品編號 LTV-200）中的專有試劑可與病毒形成超復(fù)合物，通過促進(jìn)病毒與細(xì)胞的相互作用，顯著提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

文獻(xiàn)參考：

1. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P. and Wilson, J. M. (2001) Hum Gene Ther 12:71–6.

2. Brument, N., Morenweiser, R., Blouin, V., Toublanc, E., Raimbaud, I. et al. (2002) Mol Ther 6:678–86.

3. Clark, K., Liu, X., McGrath, J., and Johnson, P. (1999) Hum. Gene Ther., 10, 1031-1039.

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5. Dudek A.M., Pillay S., Puschnik A.S., Nagamine C.M., Cheng F., Qiu J., Carette J.E.,Vandenberghe L.H. (2018) J. Virol. 92, 2213-17.

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Cell Biolabs公司位于美國加利福尼亞州南部重要的工業(yè)城市圣迭戈（San Diego），是有名的細(xì)胞學(xué)試劑品牌，作為前沿的細(xì)胞學(xué)分析檢測試劑盒生產(chǎn)商，為生物技術(shù)和研究類客戶提供好的基于細(xì)胞功能研究以及疾病等方面的高端產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)。產(chǎn)品主要涵蓋細(xì)胞研究、細(xì)胞信號通路和蛋白質(zhì)生物學(xué)、代謝研究、病原體和毒素、干細(xì)胞研究等領(lǐng)域。全球眾多大學(xué)、政府研究機(jī)構(gòu)、生物、制藥企業(yè)的科研實(shí)驗(yàn)室均在使用Cell Biolabs的產(chǎn)品。