抗微管蛋白抗體（貨號(hào)#ATN02）是一種親和純化的綿羊多克隆抗體，可對(duì)α和β微管蛋白發(fā)生反應(yīng)。用于抗體生產(chǎn)的免疫原是純化微管蛋白的混合物，因此該抗體具有從酵母到人類的廣泛物種交叉反應(yīng)性。豬提取物（貨號(hào)#EXT03）作為陽(yáng)性對(duì)照包括在內(nèi)，ATN02在蛋白質(zhì)印跡上鑒定出55 kD的特征微管蛋白條帶（見(jiàn)圖1）。ATN02以凍干白色粉末形式提供。

圖1.抗微管蛋白抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)樣品并按照方法所述轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將ATN02抗體稀釋至50 0 ng/ml （1：1000）進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。在10μg牛腦提取物中檢測(cè)到微管蛋白（見(jiàn)55kD處的箭頭）。分子量標(biāo)記物來(lái)自Invitrogen。

圖2.用抗微管蛋白多克隆抗體探測(cè)的細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡（貨號(hào)#ATN02）。果蠅 S2 細(xì)胞提取物（50 μg，泳道 1）、非洲爪蟾 A6 細(xì)胞（50 μg，泳道 2）、小鼠瑞士 3T3 細(xì)胞（50 μg，泳道 3）、大鼠 NRK 細(xì)胞（50 μg，泳道 4）、人 HeLa 細(xì)胞（50 μg，泳道 5）和牛腦（50 μg，泳道 6）提取物中微管蛋白的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)在 55 kD（見(jiàn)箭頭）。用500 ng/ml（1：1000）稀釋的ATN02探測(cè)印跡。

儲(chǔ)存和重組：

在環(huán)境溫度下運(yùn)輸。凍干蛋白可在4℃下干燥保存6個(gè)月。對(duì)于重構(gòu)，應(yīng)短暫離心產(chǎn)品管，以收集管底部的粉末。

將每根試管在100μl Mili-Q水加30%甘油中重新配制，并在4℃下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月。為防止細(xì)菌在4℃下生長(zhǎng)，添加50μg/ml硫酸慶大霉素或其他抗菌劑。對(duì)于超過(guò)一個(gè)月的儲(chǔ)存，抗體應(yīng)等分并在70°C下儲(chǔ)存。

將腦提取物陽(yáng)性對(duì)照蛋白重新懸浮在500μl 1x SDS-PAGE樣品加載緩沖液中，最終濃度為2 mg/ml，等分為20 X 25μl量（各50μg），并在20°C下儲(chǔ)存。

艾美捷抗總微管蛋白羊多抗蛋白質(zhì)印跡（WB）應(yīng)用：

按照1:1000稀釋度的方法使用，足夠200 ml的工作強(qiáng)度Ab。

Western印跡法：

1.在SDS-PAGE上運(yùn)行蛋白質(zhì)樣品和對(duì)照樣品。

2.在電印跡之前，在室溫下將凝膠在蛋白質(zhì)印跡緩沖液（25mM Tris pH 8.3，192mM甘氨酸，5%甲醇）中平衡15分鐘。

3.在75V下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上60分鐘，或在20V下4℃下過(guò)夜。

4.用TBST洗滌膜一次10分鐘（10mM Tris-HCl pH 8.0150mM NaCl，0.05%吐溫20）。

5.在室溫下，在持續(xù)攪拌的情況下，用TBST中的5%脫脂奶粉封閉膜表面30分鐘。

6.將膜與在TBST/1%脫脂乳中稀釋的ATN02抗體的1:1000稀釋液在室溫下孵育1h或在4°C下持續(xù)攪拌過(guò)夜。

7.在TBST中洗滌膜3次，每次5分鐘。

8.我在室溫下用TBST/1%脫脂乳中的抗綿羊二級(jí)抗體的適當(dāng)稀釋液（例如1:20000）對(duì)膜進(jìn)行浸泡60分鐘。

9.在TBST中洗滌膜6次，每次10分鐘。

10.使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)信號(hào)

（例如，SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate；ThermoFisher）。

IF方法：

1.在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞，使其達(dá)到所需的融合度。

2.取出培養(yǎng)基，用isotemp PBS（37℃）輕輕清洗細(xì)胞一次。

3.用甲醇在-20°C下固定細(xì)胞3分鐘。

4.用PBS洗滌細(xì)胞三次。

5.將蓋玻片的細(xì)胞面朝上放在培養(yǎng)皿內(nèi)的石蠟?zāi)ど稀Ｔ谟猩w的培養(yǎng)皿里放一張濕濾紙，以保持潮濕的空氣。向每個(gè)蓋玻片中加入100μl滲透緩沖液（1%Triton X-100，PBS），孵育20分鐘。

6.去除滲透緩沖液，加入100μl塊緩沖液（PBS中的3%BSA），并培養(yǎng)30分鐘。

7.用PBS清洗蓋玻片一次。

8.將100-200μl 1:500稀釋的ATNO2抗體在封閉緩沖液中加入到每張蓋玻片中。

9.在滲透緩沖液中洗滌每個(gè)蓋玻片三次（孵育5分鐘）。

10.在封閉緩沖液中向每張蓋玻片中加入200μl 1:500稀釋的羅丹明綴合的抗綿羊抗體。培養(yǎng)30分鐘。

11.將每個(gè)蓋玻片在PBS中洗滌三次（每次靜置5分鐘）。

12.在PBS中用200μl的100nM DAPl對(duì)DNA進(jìn)行反染色5分鐘。

13.將蓋玻片倒置在載玻片上的一滴防褪色安裝介質(zhì)上。用紙巾輕輕地去除多余的培養(yǎng)基，讓安裝的培養(yǎng)基干燥。

14.使用配備有適用于羅丹明和DAPI熒光團(tuán)的過(guò)濾裝置的熒光顯微鏡檢查染色的蓋玻片。

15.將幻燈片保存在4攝氏度的黑暗中。

16.典型結(jié)果如圖2所示。

Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學(xué)和細(xì)胞過(guò)程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)。公司提供藥物篩選、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM）、細(xì)胞骨架研究相關(guān)的系列試劑盒和產(chǎn)品，尤其以細(xì)胞骨架相關(guān)研究見(jiàn)長(zhǎng)，既能滿足于樣品較少的科學(xué)研究，也可以用于小規(guī)模篩選研究和高通量大規(guī)模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動(dòng)蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現(xiàn)有產(chǎn)品的藥物篩選服務(wù)。