重組HEK293細胞系表達全長人類CD40（也稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員5；TNFRSF5）。通過流式細胞儀和西方印跡確認(rèn)表達。NF?B熒光素酶報告基因構(gòu)建體穩(wěn)定地整合到基因組中。因此，螢火蟲熒光素酶基因由位于TATA啟動子上游的4個NF-kB響應(yīng)元件控制。在CD40激動劑激活后，NF-?B轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA響應(yīng)元件上，誘導(dǎo)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。通過測量熒光素酶活性來量化CD40的激活。

CD40/NF-κB熒光素酶報告基因HEK293細胞系示意圖

背景

CD40是TNF受體超家族的成員，表達于B淋巴細胞、抗原呈遞細胞（APCs）如單核細胞、嗜堿細胞和樹突狀細胞，以及非免疫細胞如內(nèi)皮細胞和上皮細胞。該蛋白在幾種類型的癌瘤中過表達。CD40與CD4+ T輔助淋巴細胞上的CD40配體（CD40L，CD154）相互作用，觸發(fā)細胞間粘附分子（ICAM）和其他促炎細胞因子的表達。CD40：CD40L信號增加抗原特異性T細胞的激活。CD40還激活NF-κB依賴的信號，以響應(yīng)革蘭陰性細菌病原體上的脂多糖（LPS）。此外，激動型CD40單克隆抗體激活抗原呈遞細胞（APC）并促進抗腫瘤T細胞反應(yīng)，以及培養(yǎng)具有控制癌癥潛力的細胞毒性髓樣細胞，即使在缺乏T細胞免疫的情況下。CD40被認(rèn)為是癌癥免疫治療的潛在靶標(biāo)。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品CD40/NF-κB 熒光素酶報告基因 HEK293 細胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用：

? 篩選和表征CD40的潛在激動劑或抑制劑

? 在細胞系統(tǒng)中研究CD40激動劑和拮抗劑對NK-κB信號的影響

細胞培養(yǎng)協(xié)議

細胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細胞的小瓶大約60秒。細胞一旦解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1（不含慶大霉素或潮霉素）的試管中。如果將細胞在37°C的水浴中放置過久，將導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并用5毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1（不含慶大霉素或潮霉素）重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基1（不含慶大霉素或潮霉素），并在37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細胞應(yīng)在完全融合前進行傳代。在第一次傳代和后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基1A（含慶大霉素和潮霉素）。

細胞傳代

1. 抽吸培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1A并轉(zhuǎn)移到試管中。以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并用含慶大霉素和潮霉素的生長培養(yǎng)基1A重懸細胞。每周一次或兩次按照大約1:5的期望傳代比例將細胞種植到新的培養(yǎng)容器中。

細胞冷凍

1. 抽吸培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基1A并計數(shù)細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并在4°C冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796，或10% DMSO + 90% FBS）中重懸細胞，細胞濃度約為2 x 10^6個細胞/毫升。

4. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

注意：建議在早期傳代時擴增細胞并至少冷凍10個小瓶以備將來使用。

圖1：CD40/NFkB熒光素酶報告基因HEK293細胞系中人類CD40的表達。

通過西方印跡（左圖）使用特定的CD40抗體（Santa Cruz Biotechnology #sc-975）評估CD40蛋白的表達。Calnexin（Cell Signaling Technology #2433）用作加載對照。CD40/NFkB熒光素酶報告基因HEK293細胞用APC標(biāo)記的抗人CD40抗體（克隆5C3，Biolegend #334323）染色，并通過流式細胞儀分析（右圖）。Y軸是細胞數(shù)量百分比。X軸是PE的強度。

文獻參考：

1. Li G, et al. (2013) Human Genetics in Rheumatoid Arthritis Guides a High-Throughput Drug Screen of the CD40 Signaling Pathway. PLoS Genet. 9: e1003487

2. Pontrelli P, et al. (2006) CD40L Proinflammatory and Profibrotic Effects on Proximal Tubular Epithelial Cells: Role of NF-kB and Lyn. JASN. 17: 627.

3. Moschonas A, et al. (2012) CD40 Stimulates a “Feed-Forward” NF-?B- Driven Molecular Pathway That Regulates IFN-β Expression in Carcinoma Cells. J Immunol. 188: 5521.

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