GSK3α檢測試劑盒旨在使用Kinase-Glo?（Promega）作為檢測試劑，用于篩選和分析GSK3α活性的應用。GSK3α檢測試劑盒以方便的96孔格式提供，包含足夠的純化的重組GSK3α酶、GSK3α底物（GSK底物肽）、ATP和激酶檢測緩沖液，可供進行100次酶反應。

艾美捷GSK3α檢測試劑盒（BPS-79698）組成：

Reagent Amount Storage

GSK3a* 1.5μg -80℃

5x Kinase assay buffer 1.5 ml -20°℃

ATP (500 μM) 100μ -20℃

1 mg/ml GSK substrate peptide 500μ -20℃

96-well plate,white   1 Room Temp.

*GSK3α的濃度具有批次特異性，將在含有酶的試管上顯示

材料或儀器需求但未提供：

Kinase-Glo? Max 檢測試劑盒（Promega #V6071）、二硫蘇糖醇（DTT，1M；可選）、能夠讀取化學發(fā)光的微孔板閱讀器、可調(diào)節(jié)的微量移液器和無菌吸頭、30°C 恒溫箱。

應用：適用于研究酶動力學和篩選小分子抑制劑，用于藥物發(fā)現(xiàn)和高通量篩選（HTS）應用。

穩(wěn)定性：按照推薦的存儲條件，可保存長達6個月。

禁忌：保持Z終DMSO濃度低于1%。

參考文獻：McCubrey JA., 等人，Oncotarget 5(10): 2881-2911 (2014)。

GSK3α檢測試劑盒檢測協(xié)議：

所有樣品和對照應成對測試。

1、解凍5倍濃縮的激酶檢測緩沖液、ATP和1 mg/ml GSK底物肽。（可選：如果需要，向5倍濃縮的激酶檢測緩沖液中添加DTT，使其濃度達到10 mM；例如，向1 ml 5倍濃縮的激酶檢測緩沖液中添加10 ?l的1M DTT。只準備檢測所需的5倍濃縮的激酶檢測緩沖液/DTT，因為任何多余的5倍激酶緩沖液/DTT不能存儲，應當丟棄。）

2、準備母液（每孔25 ?l）：N孔 x (5 μl 5倍濃縮的激酶檢測緩沖液 + 1 ?l ATP（500 ?M）+ 5 ?l 1 mg/ml GSK底物肽 + 14 μl蒸餾水)。向每個孔中加入25 μl。

3、在水基溶液中準備10倍濃縮的抑制劑。注意：Z終DMSO濃度必須 ≤1%。更高的DMSO水平可以顯著降低酶活性。例如，要測試以100% DMSO溶解的10 ?M抑制劑，用水將1 mM抑制劑稀釋，制成10% DMSO中的100 ?M抑制劑溶液（水溶液）。然后，向檢測中添加5 ?l的100 ?M溶液，使Z終反應混合物中的DMSO濃度為1%。

4、向標記為“測試抑制劑”的每個孔中添加5 μl的抑制劑溶液。對于“陽性對照”和“空白”，添加5 μl的10% DMSO水溶液（抑制劑緩沖液）。

5、準備3 ml的1倍濃縮的激酶檢測緩沖液，將600 ?l的5倍濃縮的激酶檢測緩沖液與2400 ?l的水混合。（3 ml的1倍濃縮的激酶檢測緩沖液足夠100次反應。）只稀釋檢測所需的5倍激酶檢測緩沖液；丟棄剩余的1倍激酶檢測緩沖液。

6、向標記為“空白”的孔中加入20 μl的1倍濃縮的激酶檢測緩沖液。

7、在冰上解凍GSK3α酶。首次解凍時，短暫離心含有酶的管子以恢復管內(nèi)全部內(nèi)容物。計算檢測所需的GSK3α量，并用1倍濃縮的激酶檢測緩沖液將酶稀釋至約0.6 ng/?l。將剩余未稀釋的酶分裝后在-80°C下保存。注意：GSK3α酶對凍融循環(huán)敏感。避免多次凍融循環(huán)。不要重復使用已解凍的小瓶或稀釋后的酶。

8、通過向標記為“陽性對照”和“測試抑制劑對照”的孔中添加20 ?l稀釋后的GSK3α酶來啟動反應。仔細搖動板子并在30°C下孵化45分鐘。

9、解凍Kinase-Glo Max試劑。

10、45分鐘反應后，向每個孔中添加50 ?l的Kinase-Glo Max試劑。用鋁箔覆蓋板子并在室溫下孵化15分鐘。

11、使用微孔板閱讀器測量化學發(fā)光。應從所有孔中減去“空白”值。