CF?染料是Biotium推出的下一代熒光染料，與Alexa Fluor?、DyLight?、Cy?染料和IRDye?等其他染料相比，它在亮度、光穩(wěn)定性和水溶性方面具有綜合優(yōu)勢。CF染料dUTP可用于TUNEL染色，也可以替代標(biāo)準(zhǔn)DNA標(biāo)記和合成協(xié)議中的dTTP，以生成熒光雙鏈DNA和寡核苷酸探針。

注意：CF?405S-dUTP可能不適用于組織的TUNEL染色，因為組織中存在藍(lán)光自發(fā)熒光，且與其他CF?染料dUTP偶聯(lián)物相比，在組織切片中的摻入效率較低。同樣，CF?680R-dUTP已在細(xì)胞的TUNEL染色中進(jìn)行了測試，但在組織切片中可能無法高效摻入。

注意：對于PCR應(yīng)用，應(yīng)使用Taq聚合酶與dUTP偶聯(lián)物配合使用，因為dUTP會抑制古菌聚合酶，例如Pfu和Vent?。

1. Gold et al. (1994). Lab Invest. 71 (2):219-25.

2. Slupphaug et al. (1993). Anal Biochem. 211 (1):164-9.

3. Hogrefe et al. (2002). PNAS 99 (2): 596–601.

CF 488 A-dUTP可用于TUNEL測定，或合成用于原位雜交和核酸印跡應(yīng)用的標(biāo)記的DNA探針。CF?染料是Biotium的下一代熒光染料，與其他熒光染料相比，具有亮度，光穩(wěn)定性和共軛特異性的優(yōu)勢。綠色熒光CF?488 A染料在490/515 nm處具有激發(fā)/發(fā)射。

艾美捷CF488 A-dUTP,凍干粉（BTM-40008）特點：

1、合成異常明亮和光穩(wěn)定的熒光 DNA 探針

2、通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或凝膠檢測

3、與固定細(xì)胞或組織切片兼容

4、可選擇 8 種 CF? 染料顏色，從藍(lán)色到近紅外

細(xì)胞凋亡的末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）  

注：Biotium還提供多種顏色的CF染料TUNEL檢測試劑盒，包含平衡緩沖液、CF染料TUNEL反應(yīng)緩沖液和TdT酶。  

1. 需要但未提供的材料  

- 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，PBS）  

- 4%甲醛/PBS  

- 70%乙醇（可選）  

- PBS/0.2%Triton? X-100  

- PBS/0.1%Triton? X-100/5 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）  

- 12.5 U/μL重組末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）酶  

- 5×TdT反應(yīng)緩沖液：1 M重鉻酸鉀，125 mM Tris-HCl，1.25 mg/mL BSA，pH 6.6  

- 25 mM CoCl?溶液  

- 100 mM dATP  

2. 樣本制備  

2.1 細(xì)胞或新鮮冷凍組織切片的制備  

a) 可選：額外準(zhǔn)備一份樣本用于無TdT酶的陰性對照TUNEL反應(yīng)。  

b) 用PBS洗滌細(xì)胞或切片兩次。  

c) 在4%甲醛/PBS中固定樣本，4℃下孵育30分鐘。  

d) 用PBS洗滌兩次。  

e) 可選：將細(xì)胞保存于70%乙醇中，-20℃下可保存長達(dá)兩周。  

f) 在0.2% Triton? X-100的PBS中通透處理30分鐘，室溫下進(jìn)行。  

g) 用PBS洗滌兩次。  

2.2 石蠟組織切片的制備  

a) 可選：額外準(zhǔn)備一份樣本用于無TdT酶的陰性對照TUNEL標(biāo)記。  

b) 按照標(biāo)準(zhǔn)方法脫蠟和水化切片。  

c) 用PBS洗滌兩次。  

d) 用20 mg/mL蛋白酶K的PBS溶液在37℃下孵育切片30分鐘進(jìn)行通透處理。根據(jù)組織類型，蛋白酶K的孵育時間和溫度可能需要優(yōu)化。或者，也可以在此步驟使用微波抗原修復(fù)方法。  

e) 用PBS多次洗滌。  

3. 反應(yīng)混合液的制備  

3.1 將CF染料-dUTP稀釋至10 μM，溶劑為去離子水。  

3.2 每份樣本準(zhǔn)備100 μL TUNEL平衡緩沖液：  

- 20 μL 5×TdT反應(yīng)緩沖液  

- 20 μL 25 mM CoCl?  

- 60 μL去離子水  

3.3 每份樣本準(zhǔn)備50 μL CF染料TUNEL反應(yīng)混合液：  

| 組分 | 每次反應(yīng)的體積 | 最終濃度 |  

| 5×TdT反應(yīng)緩沖液 | 10 μL | 1× |  

| 25 mM CoCl? | 10 μL | 5 mM |  

| 100 μM dATP | 2.5 μL | 5 μM |  

| 10 μM CF染料-dUTP | 2.5 μL | 0.5 μM |  

| 12.5 U/μL TdT酶 | 1 μL | 12.5 U/反應(yīng) |  

| 去離子水 | 24 μL | |  

| 最終體積 | 50 μL | |  

可選：準(zhǔn)備一份不含TdT酶的陰性對照樣本。  

4. TUNEL染色  

4.1 用100 μL平衡緩沖液在室溫下孵育樣本5分鐘。  

a) 對于貼壁細(xì)胞或組織切片，覆蓋一層Parafilm?蓋玻片，使緩沖液均勻覆蓋細(xì)胞或組織切片。  

4.2 移除平衡緩沖液，并向每份樣本中加入50 μL反應(yīng)緩沖液。  

a) 對于貼壁細(xì)胞或組織切片，覆蓋一層Parafilm?蓋玻片，使緩沖液均勻覆蓋細(xì)胞或組織切片。  

4.3 在37℃下孵育樣本60分鐘，避光。組織切片可能需要在37℃下孵育2小時。  

a) 對于貼壁細(xì)胞或組織切片，在濕盒中進(jìn)行孵育。  

b) 對于懸浮細(xì)胞，在微孔板上使用搖床孵育，或者每隔15分鐘輕輕敲擊試管，使細(xì)胞重新懸浮于反應(yīng)緩沖液中。  

4.4 用PBS/0.1% Triton X-100/5 mg/mL BSA洗滌樣本，每次5分鐘，重復(fù)3次。  

4.5 如有需要，對樣本進(jìn)行復(fù)染。將樣本封片在熒光封片劑中，并蓋上蓋玻片進(jìn)行顯微鏡觀察，或者通過流式細(xì)胞術(shù)分析懸浮細(xì)胞。TUNEL陽性的細(xì)胞應(yīng)顯示明亮的核熒光。在沒有TdT酶的情況下，不應(yīng)觀察到染色。