類C1q蛋白3（C1q-LP3）在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中被鑒定為一種在虹鱒魚和大西洋鮭魚血漿中在細菌感染期間增加的蛋白質(zhì)（參考文獻1）。健康魚的水平約為0.1 ?g/ml，感染期間可增加至70 ?g/ml。

艾美捷Life Diagnostics鱒魚C1q-LP3 ELISA試劑盒檢測原理：

該檢測使用針對重組虹鱒魚C1Q-LP3產(chǎn)生的多克隆抗體。它能夠識別虹鱒魚和大西洋鮭魚的C1qLP3。未結(jié)合的抗體被包被在微孔板的孔中并用于捕獲。辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合物用于檢測。標準品和稀釋樣品（100 ?l）在包被有抗體的微孔中孵育45分鐘。洗滌孔后，加入HRP結(jié)合物（100 ?l）并孵育45分鐘。如果存在C1q-LP3分子，它們會被夾在捕獲抗體和檢測抗體之間形成夾心。然后洗滌孔以去除未結(jié)合的HRP結(jié)合物。加入TMB并孵育20分鐘。如果存在C1q-LP3，會產(chǎn)生藍色。通過加入終止溶液來停止顏色發(fā)展，顏色變?yōu)辄S色。在450 nm處測量吸光度。C1q-LP3的濃度與吸光度成正比，并通過標準曲線得出。

Life Diagnostics鱒魚C1q-LP3 ELISA試劑盒材料和組分：

試劑盒提供的材料：

包被有抗C1q-LP3的板（12條8孔條）

HRP結(jié)合物，11毫升

C1q-LP3庫存，1瓶，存放在-20°C

20倍洗滌溶液：TBS50-20，50毫升

稀釋液：YD50-1，2瓶 x 50毫升

四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：TMB11-1，11毫升

終止溶液：SS11-1，11毫升

儲存：

將標準品瓶存放在-20°C。試劑盒的其余部分應(yīng)存放在4°C，微孔板應(yīng)存放在帶有干燥劑的密封袋中。試劑盒自購買之日起六個月內(nèi)保持穩(wěn)定。

一般說明：

使用前應(yīng)讓所有試劑達到室溫。

當(dāng)對說明有完整理解并遵守良好的實驗室操作規(guī)范時，將獲得可靠和可重復(fù)的結(jié)果。

重要的是要快速將標準品和樣品加入ELISA板中。如果測試大量樣品，建議不要從單獨的管中將標準品和樣品分裝到ELISA板中，而是推薦以下方法：先將過量的標準品和樣品分裝到空白聚苯乙烯96孔板的孔中。然后使用8通道或12通道多道移液器快速將100 ?l的等分轉(zhuǎn)移到包被有抗體的板的孔中。

洗滌程序至關(guān)重要。洗滌不充分會導(dǎo)致精度差和吸光度讀數(shù)虛高。

實驗室溫度會影響吸光度讀數(shù)。該檢測使用設(shè)置在150轉(zhuǎn)/分鐘和25°C的搖動孵育器進行校準。在較低的溫度和混合速度下進行檢測可能會導(dǎo)致吸光度值降低。

標準品準備：

1. 庫存品為凍干狀態(tài)。根據(jù)瓶簽上顯示的稀釋液體積進行重構(gòu)，并按描述準備100 ng/ml的標準品。

2. 標記七個聚丙烯試管，分別為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0 ng/ml。每個試管中分裝0.25 ml的稀釋液。

3. 將0.25 ml的100 ng/ml C1q-LP3標準品移液到標記為50 ng/ml的試管中并混合。這便提供了50 ng/ml的C1q-LP3標準品。

4. 通過二倍系列稀釋法，同樣準備25至1.56 ng/ml的標準品。未使用重構(gòu)后的C1q-LP3應(yīng)存放在-20°C或更低溫度下。

樣品：

在Life Diagnostics的研究中，我們發(fā)現(xiàn)C1q-LP3的水平范圍從0到超過70 ?g/ml。必須通過實證來確定z佳的稀釋比例。我們建議z初以100倍稀釋（2.5 ?l的血清或血漿與247.5 ?l的稀釋液混合）對樣品進行評估。理想情況下，稀釋應(yīng)在聚苯乙烯96孔板中進行（未提供）。這允許使用8通道或12通道多道移液器快速輕松地將稀釋后的樣品轉(zhuǎn)移到包被有抗體的板上。

程序：

1. 在盒式載體中固定所需數(shù)量的8孔條。未使用的條應(yīng)存放在帶有干燥劑的密封袋中，置于4°C。

2. 向孔中分裝100 ?l的標準品和樣品。

3. 在25°C下，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速率在板式搖床上孵育45分鐘。

4. 使用板式洗滌器（每孔400 ?l），用1倍洗滌液洗孔5次。

5. 向孔中分裝100 ?l的HRP結(jié)合物。

6. 在25°C下，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速率在板式搖床上孵育45分鐘。

7. 使用板式洗滌器（每孔400 ?l），用1倍洗滌液洗孔5次。

8. 將孔猛擊到吸水紙或紙巾上，以去除所有殘留的液滴。

9. 向每個孔中分裝100 ?l的TMB。

10. 在25°C下，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速率在軌道式微孔板搖床上孵育20分鐘。

11. 20分鐘后，通過向每個孔中加入100 ?l的終止溶液來停止反應(yīng)。

12. 輕輕混合。確保所有藍色變?yōu)辄S色非常重要。

13. 在5分鐘內(nèi)，使用板式閱讀器測量450 nm的吸光度。

結(jié)果：

1. 使用曲線擬合軟件，通過將標準品的吸光度值與C1q-LP3濃度作圖，構(gòu)建標準曲線。

2. 使用繪圖軟件擬合標準曲線。我們建議使用二階多項式（二次）方程。

3. 推導(dǎo)樣品中C1q-LP3的濃度。

4. 將推導(dǎo)出的濃度乘以稀釋因子，以確定樣品中的濃度。

5. 如果樣品的吸光度值超出標準曲線范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋樣品并重新測試。

文獻參考：

1. Marancik D, Gao G, Paneru B, Ma H, Hernandez AG, Salem M, Yao J, Palti Y and Wiens GD. Whole-body transcriptome of selectively bred,resistant-, control-, and susceptible-line rainbow trout following experimental challenge with Flavobacterium psycrophilum. Frontiers in GeneticsVolume 5, Article 453 (2015). https://doi.org/10.3389/fgene.2014.00453

艾美捷科技是Life Diagnostics的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。