小鼠膠原蛋白誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(Collagen induced arthritis, CIA)與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有共同的免疫學(xué)和病理學(xué)特征。因此CIA模型被廣泛應(yīng)用于研究致病機(jī)理和治療方案的研究。盡管該模型具有高度可重復(fù)性，但要成功誘導(dǎo)高發(fā)病率和嚴(yán)重程度的關(guān)節(jié)炎，一些影響造模的因素需要考慮。

1. 影響造模的因素

a. 動物來源:即使來自不同供應(yīng)商的同樣品系的小鼠也可能會造成實驗結(jié)果的差異，建議開展實驗前先測試不同供應(yīng)商提供的小鼠。

b. 飼養(yǎng)條件和飲食：為避免細(xì)菌和病毒感染在實驗中引起的差異，建議在無特定病原體(SPF級)條件下飼養(yǎng)動物。一般來說，對于腸道菌群，不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應(yīng)答。例如，對于感染肝炎病毒（MHV）的小鼠，膠原蛋白不能誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。飲食也會影響關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，CIA在飼喂不同飼料的小鼠中差異很大。飼喂高脂肪的食物更容易引起高發(fā)病率關(guān)節(jié)炎。

c. 小鼠年齡和品系：建議使用具有成熟免疫系統(tǒng)的7-8周齡的小鼠。老齡小鼠可能對CIA的易感性較差。建議在重復(fù)實驗中使用相同周齡的小鼠。小鼠對CIA的易感性與 MHC-II 類分子相關(guān)， 同時也取決于接種二型膠原蛋白的小鼠品系。DBA/1(H-2^q)和B10.RIII(H-2^r)品系的小鼠被廣泛應(yīng)用，因為這兩個品系對CIA高度易感。DBA/1(H-2^q )小鼠，對雞，牛和豬的二型膠原有免疫應(yīng)答。B10.RIII小鼠對牛和豬二型膠原有免疫應(yīng)答，但對雞二型膠原的免疫應(yīng)答較弱。DBA/1(H-2^q)和B10.RIII(H-2^r)兩種品系小鼠對小鼠的二型膠原蛋白免疫應(yīng)答較弱，關(guān)節(jié)炎發(fā)生率低于10%。另一方面，CIA抗性的小鼠也可能產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎抗體。 表明小鼠對CIA的敏感性不僅取決于MHC類型。研究表明，CIA抗性的小鼠C57BL/6,129/Sv(H-2^b)和Balb/c(H-2^d)，當(dāng)INF-g和IL-10基因敲除后，小鼠能產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎自身抗體從而發(fā)生關(guān)節(jié)炎。這表明，對關(guān)節(jié)炎的敏感性也取決于不同細(xì)胞因子水平。下表為用于CIA及抗膠原蛋白抗體誘導(dǎo)（CAIA）的關(guān)節(jié)炎動物模型研究的常用小鼠品系。

備注： *需要含高劑量結(jié)核桿菌的完全弗式佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，（）—假設(shè)，沒有測試

d. 佐劑：含有結(jié)核桿菌的完全弗式佐劑對于誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎很重要。不同于大鼠，二型膠原加不完全弗式佐劑（不含結(jié)核桿菌）無法誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎。強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)以及正確的抗體亞型對于誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎至關(guān)重要。抗體的產(chǎn)生取決于完全弗式佐劑中結(jié)核分枝桿菌的濃度，足夠的抗膠原IgG2a和IgG2b亞型抗體水平是激活補(bǔ)體所必需的，這是誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的必要步驟。最近， Campbell等人用完全弗式佐劑（5mg/ml）在對CIA 抗性的小鼠中成功誘發(fā)高發(fā)病率的關(guān)節(jié)炎（50-70%），例如：C57BL/6, B10, and 129/Sv mice (H-2b)（10）。然而含高濃度結(jié)核桿菌的完全弗式佐劑會誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥， 所以佐劑濃度（結(jié)核桿菌含量）取決于各研究單位動物管理委員會要求。

e. 膠原蛋白：因為去糖基化的膠原會影響關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，同時一些未去除的雜質(zhì)（比如：胃蛋白酶）可能會導(dǎo)致T細(xì)胞刺激試驗中產(chǎn)生假陽性，因此二型膠原應(yīng)按規(guī)定高度純化。凍干的膠原在-20℃避光保存的條件下是非常穩(wěn)定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸(Cat#9075)中，終濃度為 2-4mg/ml，溫和攪拌，4℃過夜。膠原溶液可在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 提供較完整的不同免疫級別二型膠原。備注：DBA/1小鼠對雞或者牛的二型膠原蛋白有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，C57B/6小鼠只對雞的二型膠原蛋白有免疫反應(yīng)。

2. 膠原蛋白誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎實驗方案

a. 乳劑制備:乳劑的質(zhì)量對于誘發(fā)關(guān)節(jié)炎至關(guān)重要。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦雙注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導(dǎo)致乳劑不能夠有效的、穩(wěn)定的誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。此外，超聲處理方法將膠原至少分成2個片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。推薦使用電動的高速攪拌器：

(1) 用高速攪拌器 (圖1)（帶直徑≤5mm 的刀片，圖2a）攪拌完全佐劑CFA (或用于增強(qiáng)劑注射的不完全佐劑（IFA）)和膠原溶液。將注射器尖端用三通閥封閉 (圖2b)。把注射器夾緊，固定在鐵架臺上， 并冰浴 (圖3)。最后一步很重要，因在攪拌過程中會發(fā)熱，會引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）。

圖1. 高速攪拌器	圖2. (a) 攪拌器刀片-直徑0.5cm(b)帶三通閥的注射器（c）玻璃注射器	圖3. 帶三通閥的注射器固定在支架上，冰浴

（2）加1體積（最多不超過注射器的25%）完全弗式佐劑（不完全弗式佐劑在加強(qiáng)免疫時用到）到注射器，再緩慢加入等體積的膠原溶液（0.05M 醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度為 2mg/ml），邊低速攪拌（1000-3000rpm）邊滴入膠原溶液。注意：為保證高質(zhì)量的免疫乳劑，一次量乳劑體積應(yīng)不得超過注射器體積的50%。如果需要多量生產(chǎn)，可重復(fù)以上步驟。

（3）繼續(xù)高速混合（10,000–30,000rpm）2分鐘。冷卻5分鐘，再重復(fù)高速混合和冷卻步驟2-3次直到產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液。對于較大的體積（2-5ml），為了使乳液混合均勻，建議在混勻過程中上下移動攪拌刀片。

（4）用針頭替換三通閥，在裝有冰水的燒杯里滴一滴乳劑，檢測乳劑的穩(wěn)定性。如果乳劑是穩(wěn)定的， 如圖所示（圖4），在水中是成團(tuán)的，不散開。如果乳劑在水中散開，表明乳劑不穩(wěn)定，再加幾滴佐劑，重新混合再次進(jìn)行測試。

圖4.完整穩(wěn)定的乳劑漂浮在水面

（5）將乳劑轉(zhuǎn)移到1ml的玻璃注射器 （圖2C），不建議采用塑料注射器，因為很難做到一個準(zhǔn)確的注射劑量。備注：通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個精確的注射劑量；建議在乳劑制備好的1小時內(nèi)完成注射。乳劑在使用之前存放在4℃。

b. 免疫注射部位:在鼠尾根部皮下注射0.1ml乳劑(100ug膠原每只老鼠 （圖5）。例如：從尾根部2cm處插入針頭（25號或者27號針頭，長度5/8英尺，針插入皮下，針頭沿斜向 上與鼠尾方向平行插入，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。每次注射前充分擦拭針頭，防止乳液的露出。如果要加強(qiáng)免疫，注射部位在尾根部 3cm 處，針尖插入皮下距鼠尾根部1.5cm處。加強(qiáng)免疫的注射部位應(yīng)避開初始注射部位）。備注: Chondrex不建議使用背部皮下注射注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，因為乳劑會引起腹腔和胸腔嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

圖5. 皮下注射乳劑

c. 免疫程序: 根據(jù)小鼠品系和實驗?zāi)康牡牟煌T導(dǎo)高發(fā)病率和嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎的方法也各有不同。

(1) 通過單次免疫（無需加強(qiáng)免疫）誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（易感品系）:注射膠原和完全弗式佐劑混合而成的含2mg/ml結(jié)合桿菌乳劑。對于易感品系小鼠DBA/1（H-2^q）和 B10.RIII(H-2^r )注射乳劑后28-35天會引發(fā)關(guān)節(jié)炎。42- 56天發(fā)病率達(dá)90-100%。關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度高，臨床評分達(dá)10-12分（最高16分）。備注：由于高濃度的結(jié)核桿菌會引起免疫部位嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，因此根據(jù)各研究機(jī)構(gòu)對動物實驗的要求，可選用方案（2）或方案（4）。

(2) 通過加強(qiáng)免疫誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（易感品系）：注射膠原和完全弗式佐劑混合而成的含0.5mg/ml結(jié)合桿菌乳。在初次注射后第21天，加強(qiáng)注射膠原和不完全弗式佐劑（不含結(jié)核桿菌）混合而成的乳劑。尾部皮下注射0.1ml乳劑，避開初次免疫部位。一般在初次免疫注射后28-35天引發(fā)關(guān)節(jié)炎。在第42-56天，發(fā)病率為80-100%，臨床評分可達(dá)8-12分（最高16分）。

(3) 用高劑量的結(jié)核桿菌完全佐劑加強(qiáng)免疫誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA抗性小鼠）：對于一些低反應(yīng)的小鼠，例如：B10 (H-2^b ), C57BL/6 (H-2^b ), and C57BL/6x129/Sv (H-2^b) ，采用以下方案可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。初次免疫，尾部皮下注射0.1ml膠原和完 全佐劑混合而成的含2.5mg/ml結(jié)核桿菌的乳劑。在第21天加強(qiáng)免疫，再次注射0.1ml膠原和完全佐劑混合而成的含2.5mg/ml結(jié)核桿菌的乳劑。一般在初次免疫注射后28-35天引發(fā)關(guān)節(jié)炎。在第42-56天，發(fā)病率為50-70%。備注：該方案引起的炎癥反應(yīng)比較嚴(yán)重，根據(jù)各研究機(jī)構(gòu)對動物實驗的要求，可選用膠原抗體（CAIA） 誘發(fā)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型。Chondrex公司的單克隆抗體合劑（Arthrogen-CIA）和LPS能在CIA抗性的小鼠中誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。

(4) 通過LPS加強(qiáng)免疫：LPS和體內(nèi)二型膠原自身抗體水平對于誘發(fā)關(guān)節(jié)炎具有協(xié)同效應(yīng)(13)。此外，在經(jīng)典的CIA動物模型中，應(yīng)用LPS(B細(xì)胞分裂素)或關(guān)節(jié)炎支原體(支原體產(chǎn)生的T細(xì)胞分裂素)(MAM)或葡萄球菌B型腸毒素(金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的T 細(xì)胞分裂素)(SEB)都會加強(qiáng)關(guān)節(jié)炎發(fā)病率和嚴(yán)重程度。因此這些毒素不僅用于引發(fā)和加強(qiáng)關(guān)節(jié)炎水平，而且用于指定關(guān)節(jié)炎發(fā)生時間。這個方案，需要注射0.1ml二型膠原和含0.5mg/ml的CFA混合乳劑（參考方案(2)）。在第25-28天或在關(guān)節(jié)炎發(fā)生前3-5天腹腔注射LPS(25-50ug，溶解在生理鹽水)。關(guān)節(jié)炎將在24-48小時發(fā)生，發(fā)病率90-100%。備注：CFA免疫注射小鼠會在2-4周發(fā)生嚴(yán)重的免疫抑制。所以一些小鼠對LPS（50ug）注射非常敏感。 Chondrex建議進(jìn)行正式實驗之前先對來自不同供應(yīng)商的動物進(jìn)行測試。

d.關(guān)節(jié)炎的發(fā)作:有效的免疫注射后，臨床上明顯的關(guān)節(jié)腫脹癥狀會在3-5周出現(xiàn)。關(guān)節(jié)炎的發(fā)作和發(fā)病率取決于小鼠品系和實驗方案。