SPY555-DNA是一種基于我們SPY?染料系列的明亮且無毒的活細(xì)胞核染料。其優(yōu)化的結(jié)構(gòu)能夠快速標(biāo)記活細(xì)胞和固定細(xì)胞中的DNA，具有高特異性和極低的背景信號。SPY555-DNA可以在不需要遺傳操作或熒光蛋白過表達(dá)的情況下，對活細(xì)胞或固定細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色。其吸收和發(fā)射特性與四甲基羅丹明（TMR）相似。SPY555-DNA能夠與SPY505、SPY595、SPY650、SPY700、SiR和GFP進(jìn)行多色成像。SPY555-DNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)的TMR或Cy3濾光片組進(jìn)行成像。它適用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞和組織的寬場、共聚焦、SIM或STED成像。包含1瓶SPY555-DNA（凍干）。

艾美捷SPY555-DNA探針（#CY-SC201）：

吸收峰（λabs）：555 nm

熒光峰（λfl）：580 nm

是否適用于固定細(xì)胞：是，適用于PFA和甲醇固定的細(xì)胞

探針數(shù)量：100次染色

熒光壽命：2.4 ns

STED耗竭波長：660或775 nm

運輸條件：室溫

儲存與操作：

收到后將探針儲存于-20°C或更低溫度。凍干探針在室溫下可穩(wěn)定保存超過1周，在-20°C下可穩(wěn)定保存超過12個月。使用無水DMSO復(fù)溶SPY555-DNA。我們建議使用新開封的無水DMSO來制備1000倍濃縮液。DMSO在接觸空氣和水分時會產(chǎn)生降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物即使在-20°C下也會顯著縮短溶液中探針的保質(zhì)期。使用后，將1000倍濃縮液保存在-20°C或更低溫度。在打開前，應(yīng)將小瓶恢復(fù)至室溫。如果儲存得當(dāng)，1000倍濃縮液可穩(wěn)定保存3個月。注意：DMSO溶液應(yīng)特別小心處理，因為DMSO已知會促進(jìn)有機分子進(jìn)入組織。請按照所有相關(guān)的當(dāng)?shù)匾?guī)定處理這些試劑。

標(biāo)記協(xié)議：

注意：本協(xié)議是使用貼壁于蓋玻片的HeLa細(xì)胞優(yōu)化的，并已在其他常見細(xì)胞系中得到驗證。本協(xié)議中的建議應(yīng)作為起點，每種細(xì)胞類型的最優(yōu)標(biāo)記條件應(yīng)通過實驗確定。SPY555-DNA基于DNA小溝結(jié)合分子雙苯并咪唑。在高劑量下，它可能會改變活細(xì)胞中的DNA代謝。因此，如果計劃進(jìn)行長期（>12小時）成像實驗，建議使用1000倍或更高稀釋度的SPY555-DNA進(jìn)行染色。對于其他所有用途，建議使用1000倍稀釋度的SPY555-DNA進(jìn)行染色。

制備1000倍濃縮液：向SPY555-DNA小瓶中加入50 ?L無水DMSO，制備1000倍濃縮液。我們建議使用新開封的無水DMSO來制備1000倍濃縮液。DMSO在接觸空氣和水分時會產(chǎn)生降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物即使在-20°C下也會顯著縮短溶液中探針的保質(zhì)期。此時，溶液可能有顏色，但這不會影響探針的性能。使用后，應(yīng)將該溶液保存在-20°C或更低溫度。不要將1000倍濃縮液分裝成小份，因為它們會更快降解，且探針不會因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲存得當(dāng)，該濃縮液可穩(wěn)定保存3個月。

制備染色液：在常用的細(xì)胞培養(yǎng)基（例如DMEM + 10%胎牛血清）中將SPY555-DNA稀釋至1倍濃度，并短暫渦旋。如果稀釋不是一步完成，請使用DMSO制備中間稀釋液，因為使用水性緩沖液制備中間稀釋液會導(dǎo)致探針聚集。快速進(jìn)行下一步。由于染色效率可能因細(xì)胞系而異，建議首次嘗試時使用1000倍稀釋度進(jìn)行染色，然后在后續(xù)實驗中優(yōu)化SPY555-DNA的稀釋倍數(shù)，直至獲得最佳染色效果（參見下表中的標(biāo)記濃度和孵育時間）。僅使用新制備的染色液，不要多次使用。

細(xì)胞準(zhǔn)備和染色：按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時，用步驟2新制備的染色液替換培養(yǎng)基，確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋。將細(xì)胞置于37°C、含5% CO?的濕潤環(huán)境中孵育，并根據(jù)確定標(biāo)記時間作為探針濃度的函數(shù)。

注意：SPY555-DNA可以染色用甲醛（PFA）和甲醇固定的細(xì)胞中的DNA。

細(xì)胞成像：使用標(biāo)準(zhǔn)TMR或Cy3設(shè)置對SPY555-DNA進(jìn)行成像效果最佳。標(biāo)記后，活細(xì)胞可以立即成像，無需洗滌步驟。可選地，用不含探針的新鮮培養(yǎng)基替換一次標(biāo)記液通常可以提高信噪比。如果進(jìn)行時間序列成像，建議在整個實驗過程中保持成像介質(zhì)中含有探針，以獲得穩(wěn)定的信號。如果在成像前對細(xì)胞進(jìn)行了洗滌，染色效果將持續(xù)數(shù)小時。請注意，SPY555-DNA可能會被360-390 nm的光激發(fā)，并由于探針的DNA結(jié)合部分的熒光而在約450 nm處產(chǎn)生一些熒光。

*基于以下條件：每次染色實驗使用0.5 ml染色溶液，探針濃度為1倍。通過減少體積或探針濃度，可以進(jìn)一步增加染色實驗的次數(shù)。

**標(biāo)記時間是針對HeLa細(xì)胞確定的，可能會因使用的細(xì)胞系而有所不同。