細(xì)胞增殖導(dǎo)致許多重要的變化，包括DNA合成、細(xì)胞代謝增加和增殖特異性蛋白表達(dá)。基于熒光染色技術(shù)，BiogradetechEdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒可以直接從DNA水平準(zhǔn)確檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)，同時(shí)還可以通過細(xì)胞代謝水平高通量檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)。該試劑盒包含一個(gè)專利的增殖陰性對(duì)照，是一個(gè)完美的解決非標(biāo)準(zhǔn)化的增殖試驗(yàn)結(jié)果。目前主要包括EdU和CCK8兩種常用的檢測方法。  

艾美捷 Biogradetech EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）：

Cat #: D-AKK2030

Size: 100T

Storage: Stored at -20°C for 12 months, protected from light

EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒 供應(yīng)材料和儲(chǔ)存條件：

化驗(yàn)程序

A.用Edu標(biāo)記細(xì)胞

在本實(shí)驗(yàn)中，以在96孔板中培養(yǎng)的粘附細(xì)胞為例。EdU孵育后可以涂抹懸浮細(xì)胞（在載玻片中加入適量細(xì)胞，用酒精燈烘烤至干燥）。涂抹后，染色程序與粘附細(xì)胞相同。

1.在平板中放置合適的蓋玻片，播種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，并在處理細(xì)胞后使其生長到所需的密度。

2.可選步驟：設(shè)置陰性對(duì)照：在EdU孵育前加入DNA合成抑制劑羥基脲，按1:1000的比例直接加入陰性對(duì)照孔中，混合孵育0.5小時(shí)。

用10mM的EdU溶液在介質(zhì)中制備3.2×EdU工作溶液（20μM）。EdU的推薦最終濃度為10μM，用細(xì)胞培養(yǎng)基1:500稀釋10mM EdU可獲得2xEdU工作溶液（20μM）。

4.將相同體積的預(yù)熱（37°C）的2xEdU溶液加入到含有測試細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以將96孔板中EdU的最終濃度改變?yōu)?x。

注意：建議不要更換所有培養(yǎng)基，因?yàn)檫@會(huì)影響細(xì)胞增殖的速率；建議EdU的初始濃度為10μ。

5.在最合適的條件下培養(yǎng)細(xì)胞2小時(shí)（根據(jù)細(xì)胞擴(kuò)增的時(shí)間，一般腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為2小時(shí)）。

6.培養(yǎng)后，除去培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入0.1mL固定溶液（含有3.7%甲醛的PBS）。室溫孵育15min。

7.取出固定劑，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞5分鐘。重復(fù)3次。

8.取出洗滌劑，向每個(gè)孔中加入0.1mL滲透劑（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室溫下孵育15分鐘。

9.去除滲透劑，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞5分鐘。重復(fù)2次。

10.轉(zhuǎn)到步驟C。

B.EdU標(biāo)記活體動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)以6周齡小鼠為例，其他動(dòng)物EdU的標(biāo)記，請(qǐng)參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

1.對(duì)于小鼠，根據(jù)10-200mg/kg的劑量，EdU可以用PBS制備成一定濃度，腹膜內(nèi)注射，局部注射特定組織或器官，也可以加入飲用水中。具體劑量與所用動(dòng)物的類型、重量和使用方式有關(guān)，我們可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此建議首次使用時(shí)探索EdU的濃度，或直接使用50 mg/kg的強(qiáng)的松濃度。如果你以前在實(shí)驗(yàn)中使用過BrdU，你可以將BrdU的最終濃度稱為EdU的最終濃縮。EdU需要單獨(dú)購買。

2.可選步驟：陰性對(duì)照的設(shè)定：在EdU處理過程中加入DNA合成抑制劑羥基脲，用濃度為1000mg/kg的EdU溶液配制。羥基脲需要單獨(dú)購買。

3.24小時(shí)后或根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后，迅速殺死小鼠，取出必要的組織，并按照常規(guī)步驟制作冷凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)注的時(shí)間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)整。

4.對(duì)于冷凍切片：

（1） 加入適量固定溶液（含3.7%甲醛的PBS），室溫孵育15分鐘。

（2） 取出固定劑，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞5分鐘。重復(fù)3次。

（3） 取出洗滌劑，向每個(gè)孔中加入0.1mL滲透劑（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室溫下孵育15分鐘。

（4） 去除滲透劑，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞5分鐘。重復(fù)2次。

（5） 抗原修復(fù)（可選）：如果同時(shí)需要對(duì)靶蛋白進(jìn)行免疫熒光染色，并且需要抗原修復(fù)，可以使用合適的抗原修復(fù)液或自制的合適抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。

（6） 轉(zhuǎn)到步驟C。

5.對(duì)于石蠟切片：

（1） 脫蠟：在二甲苯中脫蠟5-10分鐘，然后換成新鮮二甲苯，然后脫蠟5-10分鐘。無水乙醇脫蠟5分鐘，無水乙醇脫蠟3分鐘。95%乙醇3分鐘.85%乙醇3分鐘75%乙醇3分鐘.50%乙醇3分鐘PBS 5分鐘。

（2） 抗原修復(fù)（可選）：如果同時(shí)需要對(duì)靶蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并且需要抗原修復(fù)，可以使用合適的抗原修復(fù)液或自制合適的抗原修補(bǔ)液進(jìn)行抗原修復(fù)。

注意：如果使用蛋白酶K或胰蛋白酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)清洗，否則殘留的酶會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

（3） 轉(zhuǎn)到步驟C。

C.EdU檢測

Biogradetech全球生命科學(xué)和醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)關(guān)鍵原料與試劑的領(lǐng)先供應(yīng)商：Biogradetech成立于2015年，總部位于美國加利福尼亞州，早期以產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)服務(wù)起家，逐步發(fā)展了廣泛的產(chǎn)品線，并將其商業(yè)化銷售，包括蛋白質(zhì)、抗體、酶、培養(yǎng)基、試劑盒和儀器。適用于細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、診斷學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液分析和高通量藥物篩選等領(lǐng)域。