背 景：

活體成像技術（optical in vivo imaging）目前主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術，生物發(fā)光法是基于熒光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化學發(fā)光的原理，將體外能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株植入動物體內(nèi)，與后期注射入體內(nèi)的底物發(fā)生反應，利用光學系統(tǒng)檢測光強度，間接反映出細胞數(shù)量的變化或細胞的定位。這項技術已被廣泛應用于多個領域，常用的有腫瘤或疾病動物模型的建立，并可用于病毒學研究、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究等。  

原 理：

目前極有代表性的熒光素酶有從螢火蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase），還有近年來研究較多的來源于夏威夷水域的一種大型海洋橈腳類(Copepod)動物獲得的高斯熒光素酶(Gaussia Luciferase)，螢火蟲熒光素酶的底物是D-Luciferin，海腎熒光素酶和高斯熒光素酶的底物是Coelenterazine。它們共同的作用原理是在ATP和熒光素酶的催化作用下，底物被氧化發(fā)光（不同底物光的顏色和波長不同），當?shù)孜镞^量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關性。  

1.D-Luciferin（D-熒光素）

D-Luciferin是螢火蟲螢光素酶的化學發(fā)光底物。 它在存在 ATP 的情況下通過螢光素酶氧化脫羧產(chǎn)生光。 D-Luciferin可用于測定與感興趣的啟動子相連的螢光素酶基因的表達。 

常見應 用：1）體外化學發(fā)光分析（in vitro）；2）活體成像實驗（in vivo）；3）高靈敏度ATP分析；  

2.Coelenterazine腔腸熒光素

Coelenterazine：普遍認為是天然的腔腸熒光素，是海腎熒光素酶（Rluc）的作用底物，具有許多用途。可用于檢測活細胞中鈣離子濃度，基因報告分析，BRET（生物發(fā)光共振能量轉移）研究，ELISA，HTS，組織或細胞中超氧陰離子和過亞硝酸鹽的化學發(fā)光檢測。 

Coelenterazine h:與Renilla熒光素酶或Gaussia熒光素酶使用具有一定的局限性。體外研究中比其他類似物更適合與鈣離子激活發(fā)光蛋白共用。據(jù)報道，Coelenterazine h的發(fā)光強度高于天然腔腸熒光素10-20倍，因此是用來檢測鈣離子濃度微小變化的有力工具。

Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的優(yōu)先選擇底物，此腔腸素衍生物在390 nm和400nm之間發(fā)藍色光，對GFP acceptor的光發(fā)射干擾小。  

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61kD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出波長為560nm左右的生物螢光(bioluminescence)，是目前體內(nèi)外檢測實驗中最常用的螢光素酶。在此基礎上還有用于高靈敏度檢測的快速降解型螢火蟲熒光素酶，例如pGL6-TA-CP(超靈敏快速降解型報告基因質(zhì)粒) (D2094)。  

海腎螢光素酶(Renilla luciferase）是一種分子量約為36kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide，反應過程無需ATP和鎂離子參與。在Coelenterazine氧化的過程中，會發(fā)出波長為480nm左右的生物螢光(bioluminescence)。  

高斯熒光素酶(Gaussia Luciferase)為單條肽鏈的單體酶，其分子量較小(20kD)，且具有分泌性信號肽，可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細胞外。因此在使用Gaussia Luciferase的報告基因載體轉染哺乳動物細胞進行表達時，無需裂解細胞，可直接使用細胞培養(yǎng)基上清進行螢光素酶活性的實時檢測。Gaussia Luciferase螢光素酶參與催化底物腔腸素的氧化反應并且發(fā)出波長為480nm左右的螢光。與其它螢光素酶相比，  

Gaussia Luciferase作為報告基因有多方面的優(yōu)勢：

• 分泌型螢光素酶，可在不同時間段直接取上清檢測，無須裂解細胞；

• 發(fā)光強度高，是其它螢光素酶的1000倍；

• 反應無須ATP，不受ATP影響；

• 穩(wěn)定性高，對溫度、pH值等耐受性強。

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