異硫氰酸熒光素 (FITC) 是熒光素的衍生物，可用于包括流式細(xì)胞術(shù)在內(nèi)的廣泛應(yīng)用。首次描述于 1942 年，F(xiàn)ITC 是用異硫氰酸酯反應(yīng)基團(tuán) (-N=C=S) 功能化的原始熒光素分子，取代了結(jié)構(gòu)底部環(huán)上的氫原子。它通常以異構(gòu)體的混合物形式提供，即 5-異硫氰酸熒光素 (5-FITC) 和 6-異硫氰酸熒光素 (6-FITC)。 FITC 對(duì)親核試劑（包括蛋白質(zhì)上的胺和巰基）具有反應(yīng)性。它由 Robert Seiwald 和 Joseph Burckhalter 于 1958 年合成。連接到熒光素核心的琥珀酰亞胺酯官能團(tuán)形成“NHS-熒光素”，形成另一種常見(jiàn)的胺反應(yīng)性衍生物，在其他親核試劑存在下對(duì)伯胺具有更大的特異性。

異硫氰酸熒光素 (FITC)具有大約 495 nm 和 519 nm 的激發(fā)和發(fā)射光譜峰值波長(zhǎng)，使其呈綠色。像大多數(shù)熒光染料一樣，它容易發(fā)生光漂白。由于光漂白問(wèn)題，Alexa 488 和 DyLight 488 等熒光素衍生物已針對(duì)需要更高光穩(wěn)定性、更高熒光強(qiáng)度或不同附著基團(tuán)的各種化學(xué)和生物應(yīng)用進(jìn)行了定制。此外，一些實(shí)驗(yàn)利用 FITC 的光漂白傾向，通過(guò)光漂白后的熒光恢復(fù)技術(shù)來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)在膜中的橫向遷移率。

艾美捷異硫氰酸熒光素相關(guān)參數(shù)：

產(chǎn)品編號(hào)：B-CHM100

規(guī)格：100毫克

存儲(chǔ)條件：在避光的條件下，存放于-20°C。

分子式：C21H11NO5S

分子量：389.38

純度：高于或等于95%（通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定）

光譜特性：激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng) = 490 / 525 納米

外觀：黃色粉末

運(yùn)輸與儲(chǔ)存

儲(chǔ)存條件：在避光的條件下，存放于-20°C。穩(wěn)定性：在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件下，至少穩(wěn)定12個(gè)月。

異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體流程：

1. 將要進(jìn)行交聯(lián)的蛋白質(zhì)（濃度為1 mg/mL）在4°C下對(duì)交聯(lián)反應(yīng)緩沖液進(jìn)行三次透析，調(diào)整pH值至9.0。制備交聯(lián)緩沖液：將7.56克碳酸氫鈉、1.06克碳酸鈉和7.36克氯化鈉溶解在水中，最終體積為1升。

2. 將FITC在DMSO中溶解，濃度為1 mg/mL。為每次交聯(lián)反應(yīng)新鮮制備FITC溶液，并避免光照。

3. 以P:F（蛋白質(zhì)：FITC）= 1 mg:150 μg的比例，緩慢地將FITC加入抗體溶液中。在加入FITC時(shí)輕輕攪拌溶液，以確保與抗體均勻混合。在4°C的暗處進(jìn)行反應(yīng)8小時(shí)。

4. 加入5 mol/L的氯化銨至最終濃度為50 mmol/L，以在4°C下停止反應(yīng)2小時(shí)。

5. 將結(jié)合物對(duì)PBS溶液進(jìn)行至少四次透析，直到透析液變清。

6. 交聯(lián)材料的特征化：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）= [A280 - 0.31 × A495] / 1.4；F/P比值：3.1 × A495 / [A280 - 0.31 × A495]。這個(gè)值應(yīng)該在2.5 ~ 6.5之間。

7. 將FITC蛋白結(jié)合物在pH 7.4的PBS中保存，添加0.1%的亞硝酸鈉和1%的牛血清白蛋白（BSA），在4°C的暗處保存。