FluoTag-X4抗GFP單結(jié)構(gòu)域抗體與天然GFP信號高度相關(guān)，在定量共定位方面優(yōu)于傳統(tǒng)GFP抗體。

在以下方法中，應(yīng)通過原生GFP信號與抗體染色信號的共定位研究來突出這一優(yōu)勢。對轉(zhuǎn)基因小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1-GFP+/-小鼠（Jung等人，2000年）的腦切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，使用的是FluoTag?-X4抗GFP抗體或傳統(tǒng)的間接免疫染色。

通過合并圖片、散點(diǎn)圖和相關(guān)系數(shù)分析共定位

共定位可以在兩個熒光信號的合并圖片中可視化。原生GFP通道（綠色 - 圖1A，2A）和抗體染色通道（紅色 - 圖1B，2B）的重疊像素顯示為黃色（圖1C，2C）。合并圖片清楚地顯示，F(xiàn)luoTag?-X4抗GFP染色結(jié)果在微膠質(zhì)細(xì)胞的不同區(qū)域產(chǎn)生了均勻的共定位，而傳統(tǒng)染色在微膠質(zhì)細(xì)胞的不同區(qū)域產(chǎn)生了波動。細(xì)胞核顯示出明亮的原生GFP信號，但只有非常微弱的抗體染色（圖2A-C，星號），這可能是由于傳統(tǒng)抗體進(jìn)入細(xì)胞核的穿透性較差或空間障礙所致。相比之下，微膠質(zhì)細(xì)胞的突起與GFP信號相比，在抗體染色下顯得更亮（圖2A-C，箭頭），很可能是由于二級試劑的高放大作用。散點(diǎn)圖是另一種有用的工具，用于可視化共定位（ImageJ，Dunn等人，2011）。在這里，每個像素的顏色強(qiáng)度相互對比（圖1D，2D）。在高共定位的情況下，點(diǎn)會圍繞一條直線聚集，如圖1D中可以很好地看到。

圖1：使用單域FluoTag?-X4抗GFP抗體的直接免疫染色。

（A）原生GFP信號，

（B）FluoTag?-X4抗GFP抗體（AB）染色，

（C）合并圖片以及

（D）帶有皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）的散點(diǎn)圖。

圖2：使用傳統(tǒng)抗GFP抗體的間接免疫染色。

（A）原生GFP信號，

（B）傳統(tǒng)抗體（AB）染色，

（C）合并圖片以及

（D）帶有皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）的散點(diǎn)圖。

這兩種可視化方法，合并圖片和散點(diǎn)圖，都表明FluoTag?-X4抗GFP染色與原生GFP信號的相關(guān)性高于傳統(tǒng)染色。接下來，使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）量化了相關(guān)性，這是一個穩(wěn)健的工具，不受增益或偏移的影響（ImageJ，Adler等人，2010，Bolte等人，2006）。如果完全正相關(guān)，PCC為1；如果沒有相關(guān)性，PCC為0。量化顯示，F(xiàn)luoTag?-X4抗GFP-At542與原生GFP信號的相關(guān)性令人印象深刻，PCC為0.9732（圖1D），而傳統(tǒng)間接抗體染色與原生GFP信號的相關(guān)性僅為0.7676（圖2D）。對每組三張圖片的分析確認(rèn)了這一結(jié)果，具有高度的統(tǒng)計(jì)顯著性p<0.001。

這個實(shí)驗(yàn)再次說明，小的直接結(jié)合的單域抗體具有單價(jià)結(jié)合特性，顯示出非常好的組織穿透性，并產(chǎn)生準(zhǔn)確反映給定蛋白表達(dá)水平和分布的染色模式。它們不受二級試劑高放大作用的影響，這使得它們在定量共定位研究中優(yōu)于傳統(tǒng)的間接免疫染色。

艾美捷Synaptic Systems 相關(guān)產(chǎn)品：

Cat.No.          Product Description

N0304-AF568-L    GFP sdAb,camelid,monoclonal,FluoTag-X4,AZdye 568

N0304-AF647-LGFP    sdAb,camelid,monoclonal,FluoTag-X4,Alexa 647

N0304-At488-LGFP    sdAb,camelid,monoclonal,FluoTag-X4,ATTO 488

文獻(xiàn)參考：

Adler et al., 2010: Quantifying Colocalization by Correlation: The Pearson Correlation Coefficient is Superior to the Mander’s Overlap Coefficient. PMID: 20653013

Bolte et al., 2006: A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. PMID: 17210054

Dunn et al., 2011: A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. PMID: 21209361

Jung et al., 2000: Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. PMID: 10805752

Prasher et al., 1992: Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. PMID: 1347277

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