Hypoxyprobe-1 Kit應(yīng)用：免疫化學(xué)檢測細(xì)胞和組織缺氧，包括免疫熒光、免疫過氧化物酶法、西方印跡法或流式細(xì)胞術(shù)。

規(guī)格：

a. Hypoxyprobe-1試劑盒包含100毫克、200毫克或1000毫克的鹽酸匹莫地爾。通常在動(dòng)物研究中使用的劑量為60毫克/公斤體重。

b. 含有60微克/毫升IgG1大鼠單克隆抗體和0.09% Proclin的雜交瘤克隆11.23.22.R的耗盡上清液，體積為1.0或2.0毫升。MAb1的最佳稀釋度需由研究人員自行確定，但在與生物素結(jié)合的Fab/2抗大鼠二級試劑、鏈霉親和素過氧化物酶和過氧化物酶底物組合時(shí)，發(fā)現(xiàn)1/50的稀釋度在大鼠腫瘤組織中能提供強(qiáng)烈的免疫染色。注意，可以使用其他的二級策略。

不包含的內(nèi)容：

不提供的二級試劑包括生物素結(jié)合的Fab/2抗大鼠二級試劑、鏈霉親和素過氧化物酶或標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化試劑，包括緩沖液、過氧化物酶底物等。

儲存：

a. 將鹽酸匹莫地爾固體在室溫下避光保存。

b. 將大鼠單克隆抗體（MAb1）冷凍保存。為避免反復(fù)凍融，建議將抗體分裝為小體積后在-20攝氏度下保存。

艾美捷Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1試劑盒（HP1-XXX）組件詳細(xì)描述：

Hypoxyprobe-1是一種取代的2-硝基咪唑，其化學(xué)名稱和唯一成分為鹽酸匹莫達(dá)唑。Hypoxyprobe-1的分子量為290.8，水溶解度為400毫摩爾，相當(dāng)于116毫克/毫升；在0.9%生理鹽水中，其紫外吸收波長為324 nm，消光系數(shù)為7020。游離堿基匹莫達(dá)唑的分子量為254.3，pKa為8.7，辛醇-水分配系數(shù)為8.5。

Hypoxyprobe-1在固態(tài)和水溶液中都具有化學(xué)穩(wěn)定性。例如，固態(tài)的Hypoxyprobe-1可以在室溫下的柔和光線下保存兩年，而沒有檢測到降解，經(jīng)過紫外和HPLC分析評估。Hypoxyprobe-1的溶液在0.9%生理鹽水中以100克/升的濃度在4°C下保存了4.5年，沒有檢測到降解（紫外和HPLC分析）。

匹莫達(dá)唑在缺氧細(xì)胞中被還原激活，激活的中間體與蛋白質(zhì)、肽和氨基酸中的硫醇（巰基）形成穩(wěn)定的共價(jià)加合物。抗體試劑MAb1與這些加合物結(jié)合，使其能夠通過免疫化學(xué)方法進(jìn)行檢測。

MAb1是一種大鼠IgG1單克隆抗體（MAb）克隆11.23.22.R，提供的形式為經(jīng)過過濾滅菌的、來自雜交瘤克隆11.23.22.R的耗竭上清液，含有60微克/毫升的MAb1和0.09%的Proclin以增加穩(wěn)定性。感興趣的組織可以通過以下方法進(jìn)行研究：在冷凍固定切片或福爾馬林固定石蠟包埋切片上進(jìn)行免疫組化；經(jīng)過組織解聚后的流式細(xì)胞術(shù)；或通過Western Blot。通常，向組織切片中添加100微升1:50稀釋的MAb1。然后應(yīng)用適當(dāng)?shù)亩壊呗砸越沂酒ツ_(dá)唑加合物。下面提供了兩種合適的實(shí)驗(yàn)方案示例。

注意：MAb1可以結(jié)合缺氧細(xì)胞中匹莫達(dá)唑的蛋白質(zhì)、肽和氨基酸加合物，但免疫組化檢測的組織處理會(huì)洗脫小分子肽和氨基酸加合物，因此缺氧的免疫組化檢測依賴于缺氧組織中匹莫達(dá)唑的蛋白質(zhì)加合物。

Hypoxyprobe-Hypoxyprobe-1 Kit檢測說明：

1.正常組織或腫瘤組織缺氧的研究始于通過靜脈輸注、腹腔注射或口服攝入Hypoxyprobe-1溶液，推薦劑量為60 mg/kg體重。對于25克的小鼠，這相當(dāng)于1.5 mg/mouse。（在小鼠中使用的劑量最高可達(dá)400 mg/kg，但沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性或組織缺氧的變化，60 mg/kg的劑量則以最低成本提供了良好的免疫染色效果。）Hypoxyprobe-1在生理鹽水中的溶解度為116 mg/ml，因此可以使用非常小的體積來給藥。

注射或攝入后，Hypoxyprobe-1會(huì)分布到包括大腦在內(nèi)的所有組織，但僅在氧濃度低于14微摩爾的細(xì)胞中與含硫蛋白形成加合物——相當(dāng)于37°C下的部分壓力PpO2 = 10 mmHg。除了腫瘤，肝臟、腎臟和皮膚等正常組織也含有部分壓力PpO2為10 mmHg的細(xì)胞。這些正常組織能夠結(jié)合Hypoxyprobe-1。

2.Hypoxyprobe-1在小鼠體內(nèi)的血漿半衰期約為25分鐘（有關(guān)參考文獻(xiàn)，請參見www.hypoxyprobe.com的FAQ鏈接）。相比之下，大鼠的血漿半衰期為45分鐘，狗為90分鐘，人類為300分鐘。通常在Hypoxyprobe-1給藥后60到90分鐘收集大鼠感興趣的組織。在取樣時(shí)，組織中殘留的Hypoxyprobe-1在組織缺氧時(shí)會(huì)被結(jié)合。然而，與在60到90分鐘實(shí)驗(yàn)中組織接觸的Hypoxyprobe-1的數(shù)量相比，殘留的Hypoxyprobe-1數(shù)量非常少，因此由于殘留的Hypoxyprobe-1導(dǎo)致的任何非特異性結(jié)合都是不可檢測的。

3.除了動(dòng)物研究，Hypoxyprobe試劑盒還可以用于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞。通常，細(xì)胞懸液在100至200微摩爾的Hypoxyprobe-1存在下，在缺氧條件下孵育1到2小時(shí)。通過細(xì)胞離心收集細(xì)胞，固定后用單克隆抗體MAb1及顯色或熒光二級試劑進(jìn)行免疫染色。

文獻(xiàn)參考：

1. Clear-Rite 3 -- a less toxic alternative to xylene -- is available from VWR (Cat# 84000-052). For dewaxing (step 2) and tissue rehydration (steps 3-7), ProbeOn Plus slides (Fisher Scientific; Cat# 15-188-52) are held vertically in a MicroProbe Staining Station (Fisher Scientific) in pairs with tissue sections facing each other. The paired slides are dipped in solvent allowing capillary action to carry solvents over the tissue sections. Solvent is removed by blotting the lower end of the slide pair on adsorbent filter paper. The dip and blot procedure is repeated a total of 10 times for each of steps 2-7.Note: These steps were designed for the MicroProbe Staining Station but other routine IHC procedures can be used.

2. Brij 35 is enzyme grade polyoxyethylene(23)lauryl ether available from Fisher Scientific (cat# BP345-500).

Alternatives to Brij35 can be used including Tris buffered saline (TBS) available from Chemicon International,

Temecula, CA (Cat# 20845) containing a final concentration of 0.1% Tween 20.

3. PBS = 10 mM phosphate buffered saline that can be prepared from tablets available from Sigma (Cat# P-4417)

Hypoxyprobe 致力于為氧代謝紊亂引起的惡性和正常組織疾病提供診斷和治療工具。

艾美捷科技是Hypoxyprobe的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。