高分辨率熔解曲線(HRM)分析預混Mix(PCR)，用于基因篩查？

發(fā)布者：艾美捷科技發(fā)布時間：2019-02-14

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【前情提示】：

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PCR試劑盒

高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析新技術(shù)，具有極高的敏感性，可以檢測出單個堿基的差異。

作為一種高效穩(wěn)健的"post－PCR"技術(shù)，它不受突變堿基位置與類型的限制，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解即可完成對樣品的分析。HRM技術(shù)因操作簡便快捷、成本低廉、結(jié)果準確，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍關(guān)注。

HRM原理：

在PCR反應前將新型DNA飽和熒光染料加入反應體系，然后將PCR產(chǎn)物直接導入高分辨熔解分析儀中，在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴增產(chǎn)物進行加熱變性，儀器的光學檢測系統(tǒng)采集、分析熒光信號并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)不同熔解曲線形狀來區(qū)分（單個）堿基差異。

最廣泛的 HRM 分析應用領域是基因篩查。基因篩查是搜索 PCR 擴增片段中是否存在未知變異，它可在測序步驟之前進行或者作為替代測序方法。由于 PCR 產(chǎn)物突變可導致 DNA 熔解曲線的形狀改變，因此它可以利用 HRM分析檢測。雜交雙鏈 DNA 樣本擴增并熔解時，其熔解曲線不同于純合野生型或突變樣本。如果操作得當，可以減少至少95%的測序工作量。隨著DNA染料和分析儀器的發(fā)展，HRM技術(shù)還將繼續(xù)完善和改進，在遺傳病分子診斷領域發(fā)揮更多的作用。

HRM應用：

• 基因篩查 (突變研究)	• 雜合性研究
• 突變分析	• 物種鑒定
• 單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 檢測	• 甲基化分析

高分辨熔解曲線分析技術(shù)(HRM) 疑問與解答

作為專注于PCR領域超過24年的高品質(zhì)試劑供應商，Solis BioDyne為您推薦，5X熱啟動EvaGreen高分辨率熔解曲線分析-預混Mix（PCR）：

名稱	貨號	兼容的PCR儀器
5x HOT FIREPol EvaGreen HRM Mix (NO ROX)	08-31-00001	Bio-Rad: CFX96™ & CFX384™ Qiagen: Rotor-Gene® 6000 Eppendorf: Mastercycler®: ep realplex2 & ep realplex4 Illumina: The Eco™ Roche: LightCycler® 480

* 不含參比染料ROX，如需要含ROX，請選擇：08-33-00001

5X熱啟動EvaGreen高分辨率熔解曲線分析-預混Mix（PCR）提供如下組分：

HOT FIREPol®DNA Polymerase
5x EvaGreen®HRM buffer
12.5 mM MgCl2 = 1x PCR solution – 2.5 mM MgCl2
dNTPs
EvaGreen®dye
BSA

（客戶僅需準備水，模板DNA，引物即可）

極高的性價比（進口品質(zhì)，國產(chǎn)價格）：

品牌	貨號	規(guī)格	目錄價（元）	單次反應價格（元）
Solis BioDyne	08-31-00001	1ml（250次）	386	1.54
Thermo	4415452	5*5ml（2500次）	18856	7.54
Qiagen	206546	25ml（2000次）	21810	10.9
DBI	DBI-2232	1000次	11000	11
天根（Tiangen）	FP210-02	500次	2480	4.96
宇恒生物（UE）	S2013	500次	2300	4.6

推薦的qPCR反應體系配置：

組分	體積	終濃度
5x HOT FIREPol® EvaGreen® HRM Mix	4 µl	1x
正向引物 (10 pmol/µl)	0.16-0.5 µl	80-250 nM
反向引物 (10 pmol/µl)	0.16-0.5 µl	80-250 nM
DNA模板	可變	可變
H2O（PCR級）	up to 20 µl
Total	20 µl

* DNA模板濃度：cDNA 0.1 pg/μl -10 ng/μl ; gDNA 10 pg/μl – 4 ng/μl

推薦的qPCR反應程序：

循環(huán)步驟	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
起始激活（熱啟動）	95ºC	12 min	1
變性	95ºC	15 s	40
退火	60º-65ºC	20 s
延伸	72ºC	20 s

發(fā)表文章實驗結(jié)果展示：

【1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?” European Journal of Human Genetics 26 (2018): 1708-1712.

Solis試劑盒

使用Solis試劑盒，分析PAX2基因4號外顯子的錯義突變

【2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.” Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.

CDKAL1基因

使用Solis試劑盒，分析CDKAL1基因SNP

HRM分析成功的關(guān)鍵：

1.保持較短的擴增片段，實現(xiàn)最高的靈敏度。與較大的擴增片段相比，100 bp 左右的擴增片段可簡化單核苷酸熔解曲線的檢測。

2.確保 PCR 擴增片段的特異性。錯配產(chǎn)物和引物二聚體可使數(shù)據(jù)解釋復雜化。引物濃度低于 200nM，MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范圍及使用熱啟動DNA 聚合酶將有助于獲得高特異性。

3.確保反應使用足夠的模板。一般而言，Ct 應低于30，以生成足夠的材料，實現(xiàn)準確的熔解分析。

除了上述的高效穩(wěn)健的HRM分析預混Mix產(chǎn)品，Solis BioDyne為客戶提供終點PCR（end-point PCR），qPCR（real-time PCR），反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription），以及其它PCR所需的配套試劑。產(chǎn)品線縱覽圖如下：

PCR配套試劑

Solis BioDyne來源于歐盟-愛沙尼亞共和國，專注PCR領域超過24年，Solis BioDyne一直致力于開發(fā)和生產(chǎn)高品質(zhì)的生命科學試劑，現(xiàn)已成為當今歐洲領先的試劑供應商之一。高標準的生產(chǎn)標準和服務使Solis BioDyne成為全球值得信賴的首選PCR供應商。我們的DNA聚合酶，PCR Master Mixes，qPCR Mixes和其它試劑被全球110多個國家的研究者所使用，包括頂級研究機構(gòu)和生物技術(shù)公司。

Solis BioDyne擁有獨家的蛋白質(zhì)穩(wěn)定技術(shù)專利，確保其PCR酶與PCR Mixes產(chǎn)品具有極高的穩(wěn)定性，研究者可以常溫運輸以及常溫下配置PCR反應體系（無需冰盒）。即使是室溫放置30天，其酶活性也沒有損耗。

作為Solis BioDyne在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供最全面的Solis BioDyne產(chǎn)品以及訂制服務。