多重標(biāo)記，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)

多重標(biāo)記是通過(guò)免疫熒光或比色 IHC/ICC 檢測(cè)多種抗原的序貫免疫標(biāo)記過(guò)程。成功檢測(cè)出一種以上的抗原需要合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)考慮到每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟積累的大量變量。在這里，Jackson詳細(xì)介紹了如何設(shè)置多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)以及執(zhí)行成功檢測(cè)所必需的一些注意事項(xiàng)。

設(shè)計(jì)多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

同時(shí)檢測(cè)一種以上抗原的抗體的選擇至少取決于兩個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)：

1、無(wú)法識(shí)別的二抗的可用性：

彼此（來(lái)自相同的宿主物種），

測(cè)定系統(tǒng)中使用的其他一抗，

內(nèi)源性免疫球蛋白存在于所研究的組織或細(xì)胞中。

2、使用分離良好的探針（酶反應(yīng)產(chǎn)物、熒光團(tuán)或電子致密粒子）。

（標(biāo)有“ML”（多重標(biāo)記）的親和純化抗體專為滿足這些標(biāo)準(zhǔn)而制備。它們包括小鼠 IgG 亞類特異性抗體和針對(duì)其他物種交叉吸附 （min X） 的抗體。）

Jackson/艾美捷多重標(biāo)簽示例：

注意：在本例中，使用的二抗不會(huì)相互調(diào)和，因?yàn)樗鼈兌际窃隗H中制造的。它們已被固相吸附，因此它們無(wú)法識(shí)別步驟 2、5 和 8 中使用的其他一抗 （min X）。此外，它們不與內(nèi)源性小鼠 Ig 發(fā)生反應(yīng)，內(nèi)源性小鼠 Ig 可能存在于小鼠組織中。

注意：不要用正常血清稀釋任何抗體或?qū)⒖贵w混合在一起以節(jié)省時(shí)間，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致免疫復(fù)合物的形成和背景增加。

多標(biāo)記協(xié)議生成器

此工具可能有助于設(shè)計(jì)您的實(shí)驗(yàn)。它將應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定一抗之間的潛在交叉反應(yīng)性，從而確定每種二抗所需的最小交叉反應(yīng)性。

輸入樣品種類和要使用的抗體。所有二抗最好使用相同的宿主物種，以盡量減少交叉反應(yīng)的可能性。可以通過(guò)直接編輯表格中的文本來(lái)自定義抗原名稱。

請(qǐng)注意，即使工具指示，也可能無(wú)法提供所有潛在的最小交叉反應(yīng)性排列。山羊和驢通常是合適的二抗宿主物種選擇，因?yàn)榻徊娣磻?yīng)性選擇極少。

標(biāo)記來(lái)自同一宿主物種的一抗

親和純化的二抗的單價(jià) Fab 片段用于覆蓋（阻斷）免疫球蛋白表面，以雙重標(biāo)記來(lái)自同一宿主物種的一抗，或阻斷組織切片或細(xì)胞表面的內(nèi)源性免疫球蛋白。它們可用于這些目的，因?yàn)?nbsp;Fab 片段只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)（即它們是單價(jià)的）。

標(biāo)記與樣品相同物種的一抗

有時(shí)可能需要使用與樣品相同物種的一抗，例如Mouse on Mouse。在這些情況下，二抗也可能檢測(cè)到內(nèi)源性免疫球蛋白，從而引起不需要的背景。這可以通過(guò)Fab片段阻斷來(lái)避免。

其他注意事項(xiàng)

阻塞

對(duì)于一般封閉目的，來(lái)自與二抗宿主相同的物種的正常血清 （5% v/v） 可有效降低非特異性、保守序列和/或 Fc 受體結(jié)合的背景。

抗體的特異性有害反應(yīng)可以用二抗的單價(jià)Fab片段阻斷。這種類型的封閉適用于標(biāo)本和一抗屬于同一物種的情況（例如小鼠標(biāo)記上的小鼠），或者當(dāng)在同一宿主動(dòng)物中產(chǎn)生多種一抗時(shí)。

可視化

成功的多重標(biāo)記取決于探頭的使用，其信號(hào)可以通過(guò)可用設(shè)備進(jìn)行區(qū)分。

熒光顯微鏡是多重標(biāo)記的通用平臺(tái)，因?yàn)闉V光片組被設(shè)計(jì)用于區(qū)分許多可用的熒光團(tuán)。窄帶通發(fā)射濾光片對(duì)于從多個(gè)熒光基團(tuán)分離信號(hào)、抑制重疊光譜中的熒光檢測(cè)至關(guān)重要。在規(guī)劃多標(biāo)記方案時(shí)，應(yīng)從熒光基團(tuán)配制染料組合，該熒光基團(tuán)具有與現(xiàn)有儀器兼容的發(fā)射光譜。

酶聯(lián)抗體也可以實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。用一抗和二抗標(biāo)記抗原位點(diǎn)，然后用顯色底物（如 DAB、TMB 或 AEC）顯色。其他抗原位點(diǎn)按順序標(biāo)記，每個(gè)抗原位點(diǎn)使用不同的顯色劑。

對(duì)于電子顯微鏡中的多重標(biāo)記，不同大小的膠體金顆粒與二抗復(fù)合，可以清晰地顯示不同的抗原位點(diǎn)。

控制

在執(zhí)行多重標(biāo)記方案之前，優(yōu)化每個(gè)一抗/二抗對(duì)的條件。滴定一抗和二抗將識(shí)別低背景和合適的陽(yáng)性信號(hào)的情況。為了證明每種二抗對(duì)其預(yù)期一抗的特異性，請(qǐng)嘗試用“錯(cuò)誤”的二抗（陰性對(duì)照）標(biāo)記一抗。

當(dāng)使用在與標(biāo)本物種相同的宿主中產(chǎn)生的一抗時(shí)（例如小鼠對(duì)小鼠），對(duì)照可用于確定非特異性信號(hào)的水平。

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