磷酸化BTK (Y223) 檢測(cè)試劑盒是一種均相的時(shí)間分辨福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）夾心免疫分析。THUNDER?細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)工作流程包括三個(gè)步驟（見(jiàn)圖2）。在細(xì)胞處理后，首先使用試劑盒中提供的特定裂解緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。然后，在簡(jiǎn)單的“添加-孵育-測(cè)量”格式中，利用一對(duì)熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的磷酸化BTK (Y223)（單步試劑添加，無(wú)需洗滌步驟）。其中一種抗體用供體熒光染料（銪螯合物；Eu-Ab1）標(biāo)記，另一種則用遠(yuǎn)紅色受體熒光染料（FR-Ab2）標(biāo)記。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER 磷酸化BTK (Y223)時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)試劑盒#KIT-BTKP-100檢測(cè)原理：

這兩種標(biāo)記抗體與目標(biāo)蛋白上不同的表位結(jié)合，發(fā)生在溶液中，使兩種染料靠近。用閃光燈（320或340 nm）或激光（337 nm）激發(fā)供體銪螯合物分子后，會(huì)觸發(fā)從供體到受體分子的FRET，進(jìn)而在665 nm處發(fā)出TR-FRET信號(hào)。銪螯合物殘余能量會(huì)在615 nm處產(chǎn)生光信號(hào)。665 nm處的信號(hào)與細(xì)胞裂解液中磷酸化BTK (Y223) 的濃度成正比。數(shù)據(jù)可以表示為665 nm處的信號(hào)或665 nm與615 nm的比值。

試劑盒組成：

Eu-Phospho-BTK（5 ?L）

Acc-Phospho-BTK（20 ?L）

BTK對(duì)照裂解液（500 ?L）

5倍裂解緩沖液2（1 mL）

10倍TR-FRET檢測(cè)緩沖液（50 ?L）

100倍磷酸酶抑制劑混合液（50 ?L）

互補(bǔ)試劑：

THUNDER?裂解緩沖液2（5倍）

THUNDER? TR-FRET檢測(cè)緩沖液（10倍）

THUNDER?磷酸酶抑制劑混合液（100倍）

驗(yàn)證數(shù)據(jù)：

本試劑盒已通過(guò)驗(yàn)證，可用于使用2板檢測(cè)協(xié)議對(duì)Raji細(xì)胞裂解液中磷酸化BTK（Y223）的相對(duì)定量檢測(cè)。

細(xì)胞培養(yǎng)：非貼壁細(xì)胞在RPMI+10% FBS中培養(yǎng)，隨后經(jīng)過(guò)離心并重懸于無(wú)血清的RPMI中，達(dá)到所需密度。

細(xì)胞處理：細(xì)胞處理后，使用5倍裂解緩沖液2（最終濃度為1倍）裂解細(xì)胞，裂解緩沖液中補(bǔ)充了稀釋5倍的100倍磷酸酶抑制劑混合液。

孵育與檢測(cè)：在室溫下于振蕩器（400 rpm）孵育30分鐘后，將裂解液（15 ?L）轉(zhuǎn)移至384孔檢測(cè)板，并加入標(biāo)記抗體Eu-Ab1和FR-Ab2（5 ?L）用于檢測(cè)磷酸化BTK（Y223）。

信號(hào)讀取：在室溫孵育4小時(shí)后，記錄665 nm和615 nm處的TR-FRET信號(hào)（EnVision?）。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，Raji細(xì)胞（每孔20萬(wàn)細(xì)胞，三重復(fù)）與Pervanadate的系列稀釋液在37℃下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Pervanadate處理可刺激Raji細(xì)胞中BTK在Y223位點(diǎn)的磷酸化。

Raji細(xì)胞（每孔20萬(wàn)細(xì)胞，三重復(fù)）與Ibrutinib的系列稀釋液在37℃下孵育60分鐘，隨后用150 ?M Pervanadate在37℃下刺激30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，Ibrutinib處理可抑制Pervanadate誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞中BTK在Y223位點(diǎn)的磷酸化。

Raji細(xì)胞（每孔20萬(wàn)細(xì)胞）分別在有無(wú)200 ?M Pervanadate的條件下在37℃下孵育30分鐘。每組處理使用48個(gè)孔來(lái)確定Z'因子值。Z'因子值為0.74，表明該檢測(cè)方法穩(wěn)健且適用于高通量篩選（HTS）。

Phospho-BTK (Y223)檢測(cè)試劑盒常規(guī)測(cè)試使用Pervanadate處理的Raji細(xì)胞裂解液。Raji細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、離心后，以1000萬(wàn)細(xì)胞/mL的密度重懸，并用200 ?M Pervanadate在37℃下刺激30分鐘。細(xì)胞裂解后，用5倍裂解緩沖液2（最終濃度：1倍）對(duì)裂解液進(jìn)行系列稀釋，并進(jìn)行三重復(fù)檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示，裂解液稀釋度與TR-FRET比值呈線性關(guān)系。

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