胰蛋白酶是一種由胰腺產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，以無活性的前體酶形式存在。它被分泌到小腸中，通過腸激酶激活。胰蛋白酶傾向于在肽鏈中堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸）的羧基側(cè)進(jìn)行切割。胰蛋白酶在多種生物技術(shù)應(yīng)用中被使用，例如細(xì)胞和組織培養(yǎng)、肽序列分析以及細(xì)胞分離。AkrivisBio的胰蛋白酶檢測是一種動力學(xué)檢測，使用胰蛋白酶底物（GPK-pNA）。當(dāng)被胰蛋白酶切割時，釋放出的對硝基苯胺（p-NA）具有強(qiáng)烈的顏色，最大吸收波長為405納米，這使得檢測能夠檢測到低至每樣本0.05-0.1mU的胰蛋白酶活性。

艾美捷胰蛋白酶活性測定試劑盒：

貨號：MA-0128

規(guī)格：100孔

樣本類型：血清、血漿、細(xì)胞裂解液、組織提取液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)基

適用物種：通用（適用于所有物種）

檢測方法：比色法，檢測波長405納米

檢測類型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的比色法檢測，用于定量檢測廣泛樣本中的胰蛋白酶活性。

靈敏度：0.05-0.1mU

儲存條件：4°C

運(yùn)輸條件：凝膠冷藏包

胰蛋白酶活性測定試劑盒檢測組分：

-檢測緩沖液：25毫升，貨號WMMA-0128-A

-GPK-pNA溶液：200微升，紅色，貨號MA-0128-B

-胰蛋白酶陽性對照：凍干粉，藍(lán)色，貨號MA-1028-C

-p-NA標(biāo)準(zhǔn)品（0.8mM）：400微升，黃色，貨號MA-1028-D

-胰蛋白酶抑制劑：100微升，紫色，貨號MA-0128-E

-胰凝乳蛋白酶抑制劑：100微升，白色，貨號MA-0128-F

胰蛋白酶活性測定試劑盒檢測原理：

1.胰蛋白酶切割GPK-pNA，釋放出游離的p-NA到溶液中。

2.通過吸光度測定p-NA含量，其消光系數(shù)為6.993mM??cm??。

儲存和處理：

儲存于4°C。打開試劑瓶前請短暫離心。使用前將所有組分恢復(fù)至室溫。

-GPK-pNA、p-NA標(biāo)準(zhǔn)品、胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑：直接使用。

-胰蛋白酶陽性對照：用100微升檢測緩沖液溶解。如果需要在一段時間內(nèi)反復(fù)使用該試劑，建議將酶分裝成小份量并儲存于-20°C。

檢測步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：將0、5、10、15、20、25微升的p-NA標(biāo)準(zhǔn)品分別轉(zhuǎn)移至96孔板的多個孔中。用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升，得到0、4、8、12、16和20納摩爾/孔的p-NA標(biāo)準(zhǔn)系列。

2.陽性對照：將5微升陽性對照轉(zhuǎn)移至95微升去離子水中。將5微升陽性對照加入到成對的孔中，用檢測緩沖液將體積調(diào)整至每孔50微升。向其中一個孔中加入1微升胰蛋白酶抑制劑，并預(yù)孵育5分鐘，作為胰蛋白酶抑制劑對照。

3.樣本準(zhǔn)備和使用：用100微升檢測緩沖液提取組織（10毫克）或細(xì)胞（1×10?），以16,000×g離心5分鐘。將20-50微升樣本轉(zhuǎn)移至96孔板中，并用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。對于血清樣本，加入50微升至樣本孔中。重要的是，未知樣本的讀數(shù)應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。如果任何樣本超出此范圍，請適當(dāng)稀釋并重新運(yùn)行。通過用1微升胰凝乳蛋白酶抑制劑（TPCK）溶液處理成對的樣本，并在加入GPK-pNA開始反應(yīng)前預(yù)孵育10分鐘，校正非胰蛋白酶活性。

4.啟動反應(yīng)：每個反應(yīng)需要50微升反應(yīng)混合液。

5.測量：在室溫下，以405納米的波長在動力學(xué)模式下監(jiān)測所有孔，最長可達(dá)2小時。如果活性較低，可以延長監(jiān)測時間。

-注意：這是一種動力學(xué)檢測，通過吸光度隨時間的變化率來確定反應(yīng)速率，該速率與孔中活性胰蛋白酶的量成正比。應(yīng)檢查數(shù)據(jù)以確定測量中與時間呈線性變化的部分。

6.典型結(jié)果：

7.計(jì)算：

-從所有其他標(biāo)準(zhǔn)品中減去0標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)。繪制p-NA標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定斜率（OD/納摩爾）。對于所有其他孔，確定每個反應(yīng)的線性斜率（OD/分鐘）。將每個反應(yīng)速率除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，以確定每個陽性對照、測試樣本和抑制劑對照孔中的胰蛋白酶活性（OD/分鐘）/（OD/納摩爾）=（納摩爾/分鐘或mU）。

-按照以下方法將該值轉(zhuǎn)換為每樣本的胰蛋白酶活性：

-A.孔中的mU/加入孔中的樣本微升數(shù)=每微升樣本的胰蛋白酶活性（mU）

-B.每微升樣本的胰蛋白酶活性（mU）×樣本體積（微升）=每樣本的總mU

-C.每樣本的總mU/毫克組織（或細(xì)胞數(shù)量或血清微升數(shù)）=每毫克（或細(xì)胞數(shù)量或血清微升數(shù)）的mU