琥珀酸是三羧酸循環(huán)中的一個重要代謝產(chǎn)物。  

它處于一個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，提供FADH?，從而將電子引入細(xì)胞呼吸過程中的電子傳遞鏈。琥珀酸由乙酰輔酶A和草酰乙酸通過檸檬酸合酶生成，并在生成FADH?的過程中轉(zhuǎn)化為延胡索酸。琥珀酸還作為一種信號分子，參與多種細(xì)胞過程，包括炎癥、缺氧反應(yīng)和基因表達(dá)調(diào)控。在缺血等病理?xiàng)l件下，琥珀酸會積累，損害線粒體功能，并促進(jìn)氧化應(yīng)激和組織損傷。AkrivisBio的琥珀酸檢測法是一種簡單、靈敏的定量檢測方法，能夠準(zhǔn)確測定低于25微摩爾的琥珀酸。

艾美捷琥珀酸測定試劑盒：

貨號：MA-0134

規(guī)格：100孔

樣本類型：細(xì)胞裂解液、組織提取物

適用物種：所有

檢測方法：比色法，吸光度450納米

檢測類型：定量檢測

應(yīng)用：一種基于微孔板的比色法檢測方法，用于在多種樣本類型中定量檢測低于25微摩爾的琥珀酸。

靈敏度：低于25微摩爾

儲存條件：-20°C

運(yùn)輸溫度：冰凝膠包運(yùn)輸

保質(zhì)期：自發(fā)貨之日起一年

琥珀酸測定試劑盒檢測原理：

1.在ATP和輔酶A存在的情況下，琥珀酰輔酶A合成酶將琥珀酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A，同時生成ADP。  

2.己糖激酶利用ADP將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸。  

3.葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脫氫酶氧化，將NAD轉(zhuǎn)化為NADH。  

4. NADH用于還原四氮唑，生成具有最大吸收波長為450納米的高色素甲臜。

檢測試劑：

-檢測緩沖液：25毫升  

-琥珀酰輔酶A合成酶：凍干粉，紫色試劑瓶  

-己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶：凍干粉，綠色試劑瓶  

- ATP/輔酶A/葡萄糖：凍干粉，藍(lán)色試劑瓶  

- WST-8試劑：凍干粉，紅色試劑瓶  

-琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品：凍干粉，黃色試劑瓶  

儲存和處理：

使用前儲存于-20°C。使用前將檢測緩沖液恢復(fù)至室溫。打開前將所有小瓶短暫離心數(shù)秒。  

-檢測緩沖液：即用型，儲存于-20°C。  

-琥珀酰輔酶A合成酶、己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、ATP/輔酶A/葡萄糖：用220微升檢測緩沖液溶解。如果檢測需要多次使用，可分裝成小份量并儲存于-20°C。使用時置于冰上。  

- WST-8試劑：用220微升去離子水溶解。儲存于-20°C。  

-琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品：用100微升水溶解，得到40毫摩爾/升溶液。儲存于-20°C。使用時置于冰上。

檢測步驟：

1. 將微孔板讀取器預(yù)熱至37°C。  

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線：將10微升標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至990微升去離子水中，得到0.4毫摩爾/升溶液。將0、5、10、15、20、25微升的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別轉(zhuǎn)移至96孔板的一系列孔中，分別得到0、2、4、6、8、10納摩爾琥珀酸。用琥珀酸檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。  

3. 樣本準(zhǔn)備：將組織（10毫克）或細(xì)胞（10?個）直接在100微升檢測緩沖液中勻漿化。以16,000×g離心以去除顆粒物。將清亮的上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。將每個樣本的5-50微升轉(zhuǎn)移至96孔板，并用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。  

注意：  

a. 該反應(yīng)涉及輔酶A。涉及輔酶A的反應(yīng)表現(xiàn)出輔酶A酯的非酶促水解，導(dǎo)致無效循環(huán)，從而產(chǎn)生較高的背景漂移。所有樣本和標(biāo)準(zhǔn)品將以相同的速率漂移，從含有琥珀酸的樣本中減去0標(biāo)準(zhǔn)和/或背景對照可以校正背景漂移。  

b. 樣本中的NADH會產(chǎn)生背景。將此類樣本雙份運(yùn)行，使用配對孔作為背景對照。  

c. 使用1%（重量/體積）聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）對有色樣本（例如葡萄酒）進(jìn)行脫色處理。孵育5分鐘，然后通過10千道爾頓離心過濾器過濾。  

4. 啟動反應(yīng)：根據(jù)要檢測的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合液。每個孔需要50微升反應(yīng)混合液，包含以下成分：  

- 反應(yīng)混合液：檢測緩沖液42微升，琥珀酰輔酶A合成酶2微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶2微升，ATP/輔酶A/葡萄糖2微升，WST-8試劑2微升。  

- 背景對照混合液：檢測緩沖液44微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶2微升，ATP/輔酶A/葡萄糖2微升，WST-8試劑2微升。  

將50微升反應(yīng)混合液加入含有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的每個孔中，混合均勻。  

5. 測量：在37°C下，用微孔板讀取器在450納米處監(jiān)測反應(yīng)30-60分鐘，直到所有孔的吸光度平行漂移。  

6. 典型結(jié)果  

7. 計(jì)算：從所有標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)中減去0標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。該斜率定義了測量系統(tǒng)的吸光度/納摩爾。如果運(yùn)行了背景對照，則從配對樣本中減去這些值，否則從0標(biāo)準(zhǔn)品的背景值中減去。將校正背景后的樣本值除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，以獲得樣本孔中琥珀酸的納摩爾數(shù)。要將結(jié)果換算回每單位樣本中的琥珀酸納摩爾數(shù)：  

- A. 將樣本孔中的琥珀酸納摩爾數(shù)除以加入孔中的樣本微升數(shù) = 樣本中琥珀酸納摩爾/微升。  

- B. 將樣本中琥珀酸納摩爾/微升乘以離心步驟后新鮮試管中超氧化物歧化酶的總體積 = 樣本中琥珀酸的總納摩爾數(shù)。  

- C. 將樣本中琥珀酸的總納摩爾數(shù)除以組織毫克數(shù)（或細(xì)胞數(shù)量等） = 每毫克組織（或細(xì)胞數(shù)量等）中的琥珀酸納摩爾數(shù)。