DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的一種重要機(jī)制，它通過在DNA的胞嘧啶堿基（C）上添加甲基基團(tuán)（形成5-甲基胞嘧啶，5mC）來影響基因表達(dá)。這種甲基化狀態(tài)可以通過細(xì)胞分裂傳播，是細(xì)胞記憶轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制。盡管對DNA甲基化的酶促機(jī)制已有深入了解，但關(guān)于內(nèi)源性信號(hào)分子如何調(diào)節(jié)DNA甲基化機(jī)制的研究仍然較少。

一氧化氮（NO）是一種內(nèi)源性產(chǎn)生的自由基信號(hào)分子，參與多種生理過程，包括神經(jīng)傳遞、免疫反應(yīng)和血管穩(wěn)態(tài)。然而，NO在疾病狀態(tài)下的失調(diào)，特別是在癌癥中，與多種病理狀態(tài)相關(guān)。研究表明，NO合成酶（NOS2）的表達(dá)與多種癌癥類型的不良預(yù)后、高死亡率和對化療的抵抗性相關(guān)。盡管已知NO信號(hào)在癌癥中發(fā)揮重要作用，但NO如何直接調(diào)節(jié)DNA甲基化機(jī)制仍不清楚。

為了探究NO作為DNA甲基化內(nèi)源性調(diào)控因子的可能性，”Nitric oxide inhibits ten-eleven translocation DNA demethylases to regulate 5mC and 5hmC across the genome”采用了多種實(shí)驗(yàn)方法，包括體外酶活性測定、電子順磁共振（EPR）光譜、密度泛函理論（DFT）計(jì)算、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、小鼠異種移植模型以及基因組范圍的甲基化分析。

研究方法

1. 體外酶活性測定：研究團(tuán)隊(duì)使用純化的TET2催化域與所有輔因子（2-OG、Fe(II)、抗壞血酸）、底物（合成5mC-DNA寡核苷酸）以及NO供體（如Sper/NO）進(jìn)行孵育，通過MALDI-TOF-MS檢測5mC和5hmC的相對含量，以評估NO對TET2酶活性的影響。

2. EPR光譜：為了驗(yàn)證NO與TET2酶中非血紅素鐵原子的結(jié)合，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了EPR光譜分析，觀察了NO處理后的TET2酶的特征信號(hào)變化。

3. DFT計(jì)算：為了深入理解NO與TET2酶的結(jié)合機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了DFT計(jì)算，模擬了NO與鐵原子的結(jié)合過程及其穩(wěn)定性。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：研究團(tuán)隊(duì)選擇了四種人類癌細(xì)胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-668、PC-3和U251），這些細(xì)胞系均表達(dá)NOS2并能夠在體內(nèi)合成NO。通過外源性NO供體（如DETA/NO）處理細(xì)胞，研究團(tuán)隊(duì)用Epigentek的5mC（貨號(hào)P-1030）和5hmC（貨號(hào)P-1032）檢測試劑盒測定了細(xì)胞中全局5mC和5hmC的水平。

5. 小鼠異種移植模型：為了驗(yàn)證NO在體內(nèi)對DNA甲基化的影響，研究團(tuán)隊(duì)建立了NOS2表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞系來源的小鼠異種移植模型，并通過氨基胍（AG）抑制NO合成，比較了NO產(chǎn)生與否的腫瘤中5mC的水平。

6. 基因組范圍的甲基化分析：研究團(tuán)隊(duì)通過氧化還原降低代表性亞硫酸氫鹽測序（oxRRBS）技術(shù)，對長期（10天）NO處理的TNBC細(xì)胞系進(jìn)行了基因組范圍的5mC和5hmC分析，以確定NO對特定基因調(diào)控區(qū)域甲基化狀態(tài)的影響。

研究結(jié)果

1. NO抑制TET和ALKBH2酶活性：研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度的NO能夠可逆地抑制TET和ALKBH2酶的活性。通過MALDI-TOF-MS檢測，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)NO以濃度依賴的方式抑制了TET2酶對5mC的氧化，形成了5hmC。EPR光譜和DFT計(jì)算進(jìn)一步證實(shí)了NO與非血紅素鐵原子的結(jié)合，形成了二亞硝基鐵復(fù)合體（DNIC）。

2. NO增加癌細(xì)胞和腫瘤中的5mC水平：細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，外源性NO供體處理或內(nèi)源性NO合成的癌細(xì)胞中，全局5mC和5hmC水平顯著增加。小鼠異種移植模型的結(jié)果也支持了這一發(fā)現(xiàn)，NO產(chǎn)生的腫瘤中5mC水平顯著高于NO合成被抑制的腫瘤。

3. NO調(diào)控特定基因調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)：通過oxRRBS分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)NO處理導(dǎo)致特定基因調(diào)控區(qū)域（如啟動(dòng)子、基因體和增強(qiáng)子）的5mC和5hmC水平增加。這些變化與NO調(diào)控的腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)改變相關(guān)。

4. NO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組變化與患者預(yù)后相關(guān)：RNA測序分析顯示，NO處理導(dǎo)致TNBC細(xì)胞系中數(shù)百個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)或下調(diào)。值得注意的是，這些NO調(diào)控的基因在NOS2表達(dá)的乳腺癌患者腫瘤中也表現(xiàn)出類似的表達(dá)變化，并且與患者預(yù)后不良相關(guān)。

本研究中，Epigentek品牌的P-1030和P-1032試劑盒被用于全局5mC和5hmC水平的定量分析。這些試劑盒基于酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）原理，具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確測量DNA樣本中5mC和5hmC的百分比含量。

P-1030試劑盒：用于檢測DNA樣本中的全局5mC水平。通過特異性抗體識(shí)別并結(jié)合5mC，該試劑盒能夠提供DNA甲基化狀態(tài)的直接量化指標(biāo)，有助于研究DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、疾病發(fā)生發(fā)展等過程中的作用。

P-1032試劑盒：專門用于檢測DNA樣本中的5hmC水平。5hmC作為TET酶催化5mC氧化的中間產(chǎn)物，在DNA去甲基化過程中發(fā)揮重要作用。P-1032試劑盒能夠精確測量5hmC的含量，為研究TET酶活性、DNA去甲基化機(jī)制以及相關(guān)疾病提供重要信息。