外泌體是位于體內(nèi)的細(xì)胞外囊泡。特別是在液體活組織檢查中，如血漿、腦脊液、唾液、尿液、母乳等。它們的大小通常為40-100nm，是體內(nèi)最小的囊泡。

外泌體的結(jié)構(gòu)：

• 外泌體有一個含有表面蛋白的磷脂雙分子層。這些蛋白質(zhì)可以均勻地存在于所有的外泌體中，或者根據(jù)外泌體釋放的位置而獨特存在。這些表面蛋白有如：CD63，CD9，Alix。

• 外泌體包含蛋白質(zhì)、RNA和microRNA，偶爾也包含DNA。

外泌體的應(yīng)用：外泌體在體內(nèi)有特定的應(yīng)用，但也可用于其他臨床目的。它們可用于：

（1）免疫調(diào)節(jié)；

（2）組織再生；

（3）診斷；

（4）生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)；

（5）基因治療。

外泌體的純化：有多種方法可以純化外泌體。這些方法包括差速離心（differential centrifugation）、密度梯度超速離心（density-gradient ultracentrifugation）、尺寸排阻（size exclusion）、磁激活（magnetics activated）、基于polymer（polymer-based）、免疫學(xué)方法（immunological methods）和微流體（microfluidics）。

痛點：

• 其中一些純化方法不是特異性的，因為它們共同純化外泌體和其他細(xì)胞外囊泡。 這意味著當(dāng)涉及到外泌體內(nèi)容物的純化時，細(xì)胞外囊泡的內(nèi)容物也將被純化。

例如，如果外泌體沉淀中含有凋亡小體，則凋亡小體中所含的DNA也會隨著外泌體的RNA、microRNA和蛋白質(zhì)內(nèi)容物一起被純化。這可能會誤導(dǎo)潛在的分析。

• 這些方法中的大多數(shù)都需要花費(fèi)大量的時間。

例如，基于polymer的方法需要過夜孵育期。

• 其中的一些方法的低通量限制了樣本量，并最終限制了外泌體的多樣性或產(chǎn)量。

• 其中的一些方法需要在外泌體純化之前進(jìn)行預(yù)處理，以及特殊的儀器。

Norgen用于外泌體純化的SiC技術(shù)：該純化技術(shù)通過調(diào)節(jié)樣品的pH值來改變外泌體表面蛋白的電荷，使其與碳化硅技術(shù)結(jié)合。

艾美捷科技作為專業(yè)的生命科學(xué)領(lǐng)域解決方案供應(yīng)商，為您推薦獨家代理Norgen Biotek品牌的各種外泌體純化試劑盒。操作快速、靈敏、特異，允許高通量，不需要特殊的儀器或預(yù)處理。產(chǎn)品僅限用于科研學(xué)術(shù)研究用途，不得用于醫(yī)療與診斷。

Norgen試劑盒的方法原理：

（1）將引入 ExoC buffer 來調(diào)整樣品的pH值，從而改變外泌體表面蛋白質(zhì)的電荷。

（2）一旦 SiC slurry E 被加入到樣品中，改性的表面蛋白將結(jié)合到 SiC 上并形成沉淀顆粒。

（3）由于蛋白質(zhì)結(jié)合的 RNA 也會與 SiC 結(jié)合，下一步將從SiC和蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA中分離外泌體。 ExoR buffer將被引入沉淀顆粒中，并再次修飾外泌體表面蛋白。

（4）外泌體將從 SiC 中釋放出來，上清液中將包含純化的外泌體。

Norgen的SiC技術(shù)用于從外泌體中純化RNA：

（1）一旦外泌體被純化，外泌體的內(nèi)容物就可以被用來研究了。

（2）Norgen的RNA純化試劑盒也使用SiC技術(shù)：

      ①不使用苯酚或氯仿（他們有高度毒性和影響下游分析）；

②靈敏度高，意味著不需要載體RNA（這又會影響下游處理，如測序）；

③沒有大小偏差或GC含量偏差（獨特的）。

（3）注意：由于RNA的濃度較低，因此使用bioanalyzer（低至50 pg）或Norgen自己的定量試劑盒（低至1 pg）進(jìn)行RNA定量是很重要的，因為它們的檢測限很低。

由于缺乏核糖體RNA，因此RIN值和260:280比值不適用。

額外補(bǔ)充的要點：

（1）在純化外泌體和RNA方面沒有達(dá)到預(yù)期的產(chǎn)量。產(chǎn)量差異是很大；它取決于細(xì)胞的活性、健康狀況、年齡等。RNA產(chǎn)量一般在1-100 pg/μL范圍內(nèi)。

（2）Norgen試劑盒可以從新鮮或冷凍樣品中純化外泌體。但是，如果您要使用冷凍樣品，不要去除樣品中形成的蛋白質(zhì)沉淀物這點很重要，因為它會含有外泌體。

（3）優(yōu)秀文章鑒賞：Human myeloma cell- and plasma-derived extracellular vesicles contribute to functional regulation of stromal cells. Proteomics. 2021 (當(dāng)您對使用Norgen試劑盒純化的外泌體用于蛋白質(zhì)組學(xué)有疑問時，請參考這篇文章。本文展示了正確的分析方法，并證明從Norgen試劑盒中純化的外泌體可用于蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜、納米顆粒和電子顯微鏡檢查。)

該文章DOI: 10.1002/pmic.202000119

Tips：低豐度RNA的定量

（1）無法使用NanoDrop進(jìn)行定量。需要其它方法。

（2）請參閱Application Note 47 - Revised Guidelines for RNA Quality Assessment for Diverse Biological Sample Input.

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