蛋白質(zhì)-DNA相互作用在基因表達調(diào)控、基因組完整性和染色質(zhì)組織中扮演著至關(guān)重要的角色。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）是一種常用于檢測蛋白質(zhì)與DNA之間相互作用的技術(shù)，它基于與感興趣蛋白相關(guān)的DNA的富集。但是經(jīng)典的ChIP方法需要甲醛固定起始材料，交聯(lián)后，還需要對細胞裂解液進行超聲分離染色質(zhì)，繁雜冗長的操作使得ChIP存在很大的局限性。盡管后來出現(xiàn)的定向切割和核酸酶釋放（CUT&RUN）技術(shù)解決了部分問題，但是CUT&RUN技術(shù)是在未固定的完整細胞或核上原位進行的，需要通過蛋白AG-微球菌核酸酶（pAG-MNase）融合蛋白在特定抗體占據(jù)的位點切割染色質(zhì)，并隨后釋放蛋白/DNA復(fù)合物，使用的pAG-MNase融合蛋白可能會產(chǎn)生由未偶聯(lián)抗體的pAG-MNase引起的非特異性切割，這顯著限制了CUT&RUN在不同物種和細胞/組織類型中大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的使用特異性。

艾美捷EpiNext CUT&LUNCH蛋白/DNA復(fù)合物富集試劑盒（#P-2035-24）：

組分 中文名稱 體積 保存條件

WB (Wash Buffer) 洗滌緩沖液 30 ml 4℃

PB (Permeabilization Buffer) 破膜劑(通透緩沖液) 4 ml RT

PIC(Protease Inhibitor Cocktail)* 蛋白酶抑制劑混合物* 30 μl 4℃

NDE (Nuclear Digestion Enhancer) 核消化增強劑 300  μl RT

CEM (Cleavage Enzyme Mix)* 切割酶混合物* 60  μl -20℃

Positive Control Ab (H3K4me3,1 mg/ml)* 陽性對照抗體(H3K4me3,1 mg/ml)* 8μl -20℃

Non-Immune lgG (1 mg/ml)* 非免疫lgG(1 mg/ml)* 25μ 4℃

CSS (Cleavage Stop Solution) 切割終止液 30 μl RT

PDB(Protein Digestion Buffer) 蛋白消化緩沖液 5ml RT

Proteinase K(10 mg/ml)* 蛋白酶K(10 mg/ml)* 100 μl 4℃

Affinity Beads 親和珠 100 μl 4℃

DPS(DNA Purification Solution) DNA純化溶液 600 μl RT

DNA Binding Beads DNA結(jié)合珠 60  μ 4℃

Elution Buffer 洗脫緩沖液 1 ml RT

*在開蓋使用之前，將溶液離心至管底。

自備材料：

設(shè)備 ：

漩渦混合器

顯微鏡和細胞計數(shù)器

帶有48孔或96孔模塊的熱循環(huán)儀

離心機，包括臺式離心機(最高轉(zhuǎn)速可達14,000轉(zhuǎn)/分鐘)

旋轉(zhuǎn)器或滾動搖床

磁力設(shè)備(96孔PCR 板格式)

可調(diào)移液器和移液器吸頭

0.2毫升 PCR 管

1.5毫升微量離心管

試劑：

PBS (磷酸鹽緩沖液)

感興趣的抗體

細胞樣本

100%乙醇

100%異丙醇 蒸餾水

原理與步驟：

EpiNextTM   CUT&LUNCH檢測試劑盒包含了富集特定蛋白(組蛋白或強結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子)-DNA 復(fù)合物所需 的所有必要試劑，以便通過qPCR 或 NGS 從各種細胞樣本中分析蛋白質(zhì)與DNA  之間的相互作用。在這個 檢測中，細胞被滲透并暴露于感興趣的 ChIP 級抗體。使用一種獨特的核酸切割酶混合物，目標染色質(zhì)區(qū)域 兩端的DNA 序列被切割/移除。釋放的非特異性蛋白-DNA 復(fù)合物被消除，只有與抗體結(jié)合的復(fù)合物將被 選擇性回收。捕獲的蛋白/DNA 復(fù)合物中的DNA 片段被純化，可以直接用于基因特異性qPCR 或DNA 文 庫構(gòu)建，以分析蛋白質(zhì)與DNA 之間的相互作用。

實驗步驟：

步驟與所需時間：

1.抗體與目標結(jié)合   所需時間30分鐘

2.酶切割   所需時間10分鐘

3.選擇性回收和純化   所需時間60分鐘