人類 p21 活化激酶 1 蛋白（PAK）的 Rac/Cdc42 結(jié)合域已被過表達(dá)為帶有 GST 標(biāo)簽的重組蛋白，并在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中與顏色編碼的谷胱甘肽瓊脂糖珠子結(jié)合。重組蛋白（氨基酸 67-150）包括高度保守的 PBD 區(qū)域（也稱為 CRIB 區(qū)域）以及與 GTP-Rac 和 GTP-Cdc42 蛋白高親和力相互作用所需的序列。重組蛋白在其氨基末端帶有 GST 標(biāo)簽（28 kDa），其近似分子量為 34 kDa。PAK-GST 蛋白珠子（每管含 500 ?g 蛋白）以紫色凍干粉形式提供。一管 PAK02 應(yīng)足以進(jìn)行大約 25 次測定。

艾美捷PAK磁珠,Rac1/Cdc42結(jié)合域蛋白磁珠（#PAK02-A）生物學(xué)活性測定：

PAK-GST 蛋白能夠特異性識別并結(jié)合 Rac 和 Cdc42 蛋白的活性“GTP 結(jié)合”形式（1），而對 Rac 和 Cdc42 的非活性“GDP 結(jié)合”形式親和力較低。當(dāng)與顏色編碼的谷胱甘肽瓊脂糖基質(zhì)結(jié)合時，PAK-GST 蛋白珠子成為檢測 Rac 和 Cdc42 蛋白活性的便捷工具。PAK-GST 蛋白珠子的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)測定包括從加載了 GTPγS 或 GDP 的人血小板提取物中拉下 Rac 蛋白。

圖 1：PAK-GST 蛋白珠子純度測定  

將 20 ?g 的 PAK-GST 蛋白珠子樣本（分子量約為 34 kDa）通過 12% SDS-PAGE 系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離，并用考馬斯亮藍(lán)染色。蛋白定量采用 Precision Red 蛋白測定試劑（貨號：ADV02）進(jìn)行。Mark12 分子量標(biāo)記來自 Invitrogen。

圖 2：PAK-GST 蛋白珠子在體外對 Rac1 的 GTP 結(jié)合形式的特異性結(jié)合  

將 120 ?g 腦提取物加載 GTPγS（泳道 2）或 GDP（泳道 3），如方法所述。然后將提取物與 20 ?g 的 PAK-GST 蛋白珠子孵育。通過離心回收蛋白-珠子復(fù)合物，并使用針對 Rac1 的特異性單克隆抗體進(jìn)行 Western blot 分析。泳道 1 顯示 50 ng 的重組 His-Rac1 對照蛋白（注意：由于存在 6×His 標(biāo)簽，His-Rac1 的泳動位置略高于內(nèi)源性 Rac）。SeeBlue 分子量標(biāo)記來自 Invitrogen。

儲存與復(fù)溶

短暫離心以使產(chǎn)品聚集在管底。每管蛋白結(jié)合珠子應(yīng)通過加入 500 ?L 蒸餾水復(fù)溶至 1 mg/ml。復(fù)溶后，蛋白-珠子將處于以下緩沖液中：50 mM Tris，pH 7.5，50 mM NaCl，2.0%（質(zhì)量/體積）葡聚糖和 10%（質(zhì)量/體積）蔗糖。蛋白-珠子基質(zhì)將呈現(xiàn)紫色，便于檢測。儲存時，應(yīng)將顏色編碼的珠子懸浮液分裝成實驗用量大小，在液氮中快速冷凍并保存在 -70°C。在此條件下，蛋白珠子可穩(wěn)定保存 6 個月。我們推薦每次實驗測定使用 20 ?l 的分裝量（20 ?g 蛋白）（見本協(xié)議中的生物學(xué)活性測定）。為保持高生物學(xué)活性，蛋白-珠子懸浮液不應(yīng)多次經(jīng)歷凍融循環(huán)。如果在 4°C 下干燥保存至<10%濕度，凍干蛋白珠子可穩(wěn)定保存 1 年。

純度

通過掃描密度法對 12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠上考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白進(jìn)行分析，確定蛋白純度。PAK-GST 蛋白珠子的純度被確定為 88%（見圖 1）。

試劑

1. PAK-GST 蛋白珠子（貨號：PAK02）  

2. 上樣緩沖液（150 mM EDTA）  

3. 停止緩沖液（600 mM MgCl?）  

4. 洗滌緩沖液（25 mM Tris，pH 7.5，30 mM MgCl?，40 mM NaCl）  

5. 細(xì)胞裂解緩沖液（50 mM Tris，pH 7.5，10 mM MgCl?，0.3 M NaCl，2% IGEPAL）  

6. GTPγS（20 mM 溶液）  

7. GDP（100 mM 溶液）  

8. 牛腦或豬腦提取物（20 mg/ml），在 50 mM PIPES，pH 7.0，130 mM NaCl，1 mM PMSF，1 mM DTT，5 ?g/ml 胰蛋白酶抑制劑，0.5% Triton X-100 中制備  

9. 蛋白酶抑制劑混合液（貨號：PIC02）  

10. 抗 Rac1 單克隆抗體（貨號：ARC03）  

設(shè)備

1. 4°C 微型離心機(jī)  

2. SDS-PAGE 和 Western blot 裝置  

文獻(xiàn)參考：

1. Manser, E. et al. 1994. Nature. 367: 40-46.