SPY555-actin 是一種基于我們 SPY? 系列染料的明亮且無(wú)毒的 F-肌動(dòng)蛋白染料，適用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞。其優(yōu)化的結(jié)構(gòu)能夠快速標(biāo)記活細(xì)胞和固定細(xì)胞中的 F-肌動(dòng)蛋白，具有高特異性和極低背景。SPY555-actin 可以在無(wú)需遺傳操作或熒光蛋白過表達(dá)的情況下，對(duì)活細(xì)胞或固定細(xì)胞的 F-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色。它的吸收光譜和發(fā)射光譜與四甲基羅丹明（TMR）相似。SPY555-actin 可以與 SPY505、SPY595、SPY650、SPY700、SiR 和 GFP 進(jìn)行多色成像。它可以使用標(biāo)準(zhǔn)的 TMR 或 Cy3 濾光片組進(jìn)行成像，并可用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞和組織的寬場(chǎng)、共聚焦、SIM 或 STED 成像。包含一瓶 SPY555-actin（凍干品）。

艾美捷SPY555-肌動(dòng)蛋白探針（#CY-SC202）特性：

吸收峰（λabs）：555 nm  

熒光峰（λfl）：580 nm  

是否適用于固定細(xì)胞：是，適用于甲醛固定的細(xì)胞  

探針數(shù)量：100 次染色

熒光壽命：2.4 ns  

STED 消耗波長(zhǎng)：660 nm 或 775 nm  

運(yùn)輸條件：室溫  

儲(chǔ)存條件：-20°C  

儲(chǔ)存與操作  

收到后請(qǐng)將探針保存在 -20°C 或以下。凍干探針在室溫下可穩(wěn)定保存超過 1 周，在 -20°C 下可穩(wěn)定保存超過 12 個(gè)月。使用無(wú)水 DMSO 復(fù)溶 SPY555-actin。我們建議使用新開封的無(wú)水 DMSO 來制備 1000×儲(chǔ)備液。DMSO 與空氣和水分接觸會(huì)產(chǎn)生降解產(chǎn)物，這會(huì)顯著縮短探針在溶液中的保質(zhì)期，即使在 -20°C 下也是如此。使用后，請(qǐng)將 1000×儲(chǔ)備液保存在 -20°C 或以下。在打開小瓶之前，應(yīng)讓其恢復(fù)至室溫。如果儲(chǔ)存得當(dāng)，1000×儲(chǔ)備液可穩(wěn)定保存 3 個(gè)月。注意：DMSO 溶液應(yīng)特別小心處理，因?yàn)?nbsp;DMSO 已知會(huì)促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。請(qǐng)按照所有相關(guān)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理這些試劑。

圖：用共聚焦顯微鏡與STED顯微鏡成像的SPY標(biāo)記的HeLa細(xì)胞的比較。使用93X物鏡拍攝，由Spirochome提供。

標(biāo)記協(xié)議  

注意：本協(xié)議是使用貼附在蓋玻片上的 HeLa 細(xì)胞優(yōu)化的，并已在其他常見細(xì)胞系中得到確認(rèn)。本協(xié)議中的建議應(yīng)作為起點(diǎn)，每種細(xì)胞類型的最優(yōu)標(biāo)記條件應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定。SPY555-actin 基于選擇性 F-肌動(dòng)蛋白配體雅斯普霉素的衍生物。在高劑量下，它可能會(huì)改變活細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白代謝。因此，如果計(jì)劃進(jìn)行長(zhǎng)期（>12 小時(shí)）成像實(shí)驗(yàn)，建議使用 1000 倍或更高倍數(shù)稀釋的 SPY555-actin。對(duì)于所有其他用途，建議使用 1000 倍稀釋的 SPY555-actin 進(jìn)行染色。

1. 配制 1000×儲(chǔ)備液  

向 SPY555-actin 小瓶中加入 50 ?L 無(wú)水 DMSO，制備 1000×儲(chǔ)備液。我們建議使用新開封的無(wú)水 DMSO 來制備 1000×儲(chǔ)備液。DMSO 與空氣和水分接觸會(huì)產(chǎn)生降解產(chǎn)物，這會(huì)顯著縮短探針在溶液中的保質(zhì)期，即使在 -20°C 下也是如此。此時(shí)，溶液可能會(huì)有顏色，但這不會(huì)影響探針的性能。使用后，應(yīng)將該溶液保存在 -20°C 或以下。不要將 1000×儲(chǔ)備液分裝成小份量，因?yàn)樗鼈儠?huì)更快降解，且該探針不會(huì)因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲(chǔ)存得當(dāng)，該儲(chǔ)備液可穩(wěn)定保存 3 個(gè)月。

2. 配制染色液  

將 SPY555-actin 稀釋到 1×濃度，加入常用的細(xì)胞培養(yǎng)基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暫渦旋。如果不能一次完成稀釋，請(qǐng)使用 DMSO 制備中間稀釋液，因?yàn)槭褂盟跃彌_液制備中間稀釋液會(huì)導(dǎo)致探針聚集。快速進(jìn)行下一步。由于染色效率可能因細(xì)胞系而異，建議首次嘗試時(shí)使用 1000 倍稀釋液進(jìn)行染色，然后在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化 SPY555-actin 的稀釋倍數(shù)，直至達(dá)到最佳染色效果。僅使用新配制的染色液，不要重復(fù)使用。

3. 細(xì)胞準(zhǔn)備與染色  

按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時(shí)，用步驟 2 新鮮配制的染色液替換培養(yǎng)基，確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋。將細(xì)胞置于 37°C、含 5% CO? 的濕潤(rùn)環(huán)境中孵育，并根據(jù)下表確定標(biāo)記時(shí)間與探針濃度的關(guān)系。

4. 細(xì)胞成像  

SPY555-actin 的成像最好使用標(biāo)準(zhǔn)的 TMR 或 Cy3 設(shè)置。標(biāo)記后，活細(xì)胞可以立即成像，無(wú)需洗滌步驟。可選地，用不含探針的新鮮培養(yǎng)基替換一次標(biāo)記液，通常可以提高信噪比。如果進(jìn)行時(shí)間序列成像，建議在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中將探針保留在成像介質(zhì)中，以獲得穩(wěn)定的信號(hào)。如果在成像前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了洗滌，染色效果可維持?jǐn)?shù)小時(shí)。   

基于以下條件：每次染色實(shí)驗(yàn)使用 0.5 mL 1×探針濃度的染色液。通過減少體積或探針濃度，可以進(jìn)一步增加染色實(shí)驗(yàn)的次數(shù)。  

標(biāo)記時(shí)間是針對(duì) HeLa 細(xì)胞確定的，可能會(huì)因使用的細(xì)胞系而有所不同。