qPCR ProbesMaster凍干液用于使用基于DNA探針的檢測對DNA樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。建議將凍干物與雙重標(biāo)記熒光探針一起使用，例如TaqMan, 分子信標(biāo)或FRET探針。它提供了一種易于操作且功能強(qiáng)大的工具，可在高達(dá)6個(gè)數(shù)量級的寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)以極高的靈敏度和精度對樣本DNA進(jìn)行定量。凍干物在單個(gè)珠粒中包含qPCR所需的所有試劑（模板、引物和標(biāo)記的熒光探針除外）。基于優(yōu)化的熱啟動(dòng)聚合酶的混合物的高特異性和敏感性。其活性在環(huán)境溫度下被阻斷，并在初始變性開始時(shí)自動(dòng)開啟。在PCR設(shè)置過程中，熱激活可防止非特異性氰基化引物的延伸和引物二聚體在低溫下形成。

艾美捷ProbesMaster凍干制劑/qPCR探針主凍干物（PCR-156S）：

qPCR探針主凍干粉：包含抗體阻斷的熱啟動(dòng)聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、添加劑和穩(wěn)定劑以及PCR級水。

處理：qPCR主凍干粉以PCR反應(yīng)管條或96孔板的形式交付，預(yù)裝有完整的qPCR主混合物，以干燥、室溫下穩(wěn)定的格式。這種凍干粉結(jié)合了高性能與使用的便利性和穩(wěn)定性。無需進(jìn)行冷凍、解凍或在冰上移液。剩余的少量移液步驟Z小化了錯(cuò)誤或污染的風(fēng)險(xiǎn)。每個(gè)小瓶包含進(jìn)行20 ?l實(shí)時(shí)PCR檢測所需的所有組分（除了引物、雙標(biāo)記探針和模板）。要執(zhí)行PCR，只需將小瓶用引物/探針預(yù)混液填充并加入DNA模板。這種凍干粉還可以與ROX參照染料一起使用，在兼容ROX信號評估的PCR儀器中。在這種情況下，ROX染料（#PCR-351）應(yīng)以1倍濃度添加到PCR反應(yīng)中。

雙標(biāo)記DNA探針：基于雙標(biāo)記DNA探針的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)提供了一個(gè)高靈敏度和高特異性的PCR系統(tǒng)，具有多重能力。它需要兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR引物和能夠與擴(kuò)增子內(nèi)部部分雜交的DNA探針。雙標(biāo)記DNA探針的序列應(yīng)避免二級結(jié)構(gòu)和引物-二聚體形成。

引物/探針混合物的制備：在定量PCR反應(yīng)中推薦制備引物/探針預(yù)混液，以減少移液誤差。使用無菌過濾頭進(jìn)行移液，并盡量減少標(biāo)記的DNA探針暴露在光線下的時(shí)間。應(yīng)在與DNA制備或分析不同的區(qū)域進(jìn)行設(shè)置。在所有擴(kuò)增中應(yīng)包括無模板對照（NTC）。

推薦的PCR檢測凍干制劑：

1) 每個(gè)引物的Z佳濃度可能從100到500納摩爾(nM)不等。

2) 要獲得Z佳結(jié)果，可能需要對DNA探針的濃度進(jìn)行滴定，范圍在50到800納摩爾(nM)之間。

3) 退火溫度取決于所使用的引物和DNA探針的熔解溫度。

4) 延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增子的長度。建議對于Z長500堿基對(bp)的片段，使用1分鐘的時(shí)間。

分配主混合物：將引物/探針混合物徹底振蕩（Vortex）以確保均勻性。向每個(gè)PCR管或板孔分配15微升(?l)。

添加模板DNA：向每個(gè)反應(yīng)容器中加入5微升(?l)的模板DNA（或無模板對照），并蓋緊或封住管子/板。每個(gè)反應(yīng)的最終濃度不要超過10納克(ng) DNA。在循環(huán)前應(yīng)對管子或板進(jìn)行離心，以去除可能的氣泡。