SCRIPT RT-qPCR探針Master凍干液設(shè)計用于在單管中方便地進(jìn)行Z大靈敏度和特異性的RT-q聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該酶混合物基于具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的基因工程RT聚合酶，從而提高了特異性、更高的cDNA產(chǎn)量和對高度結(jié)構(gòu)化的長cDNA片段的改進(jìn)的效率。凍干物在一個試管中包含RTPCR所需的所有試劑（模板和引物除外），以確保用Z少的移液步驟快速簡便地制備。優(yōu)質(zhì)的酶混合物、超純的dNTP和優(yōu)化的完全反應(yīng)緩沖液確保了卓越的擴(kuò)增結(jié)果。SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster用于從單鏈RNA模板中擴(kuò)增雙鏈DNA。在RT步驟中，逆轉(zhuǎn)錄酶合成與RNA模板互補(bǔ)的單鏈DNA分子（cDNA）。在PCR步驟的第一個循環(huán)中，Taq DNA聚合酶合成與cDNA互補(bǔ)的DNA分子，從而產(chǎn)生雙鏈DNA模板。在隨后的循環(huán)中，DNA聚合酶以指數(shù)方式擴(kuò)增這種雙鏈DNA模板。在一步RT-qPCR中，在開始反應(yīng)之前，將RT和PCR的所有組分混合在一個試管中，從而在不打開試管的情況下依次進(jìn)行。當(dāng)應(yīng)用于分析來自多個RNA樣本的單個靶標(biāo)時，這提供了極大的便利，并將污染風(fēng)險降至Z低。

艾美捷RT-qPCR探針主凍干物/RT-qPCR master mix（PCR-159S）：

SCRIPT RT-qPCR 探針主凍干粉：包含預(yù)裝的SCRIPT逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動聚合酶抗體+、dNTPs（去氧核苷酸三磷酸）、反應(yīng)緩沖液、MgCl2和穩(wěn)定劑的凍干粉。PCR級水。

處理：SCRIPT RT-qPCR 探針主凍干粉以PCR反應(yīng)管條或96孔板的形式交付，預(yù)裝有完整的qPCR主混合物，以干燥、室溫下穩(wěn)定的格式。這種凍干粉結(jié)合了高性能與使用的便利性和穩(wěn)定性。無需進(jìn)行冷凍、解凍或在冰上移液。剩余的少量移液步驟Z小化了錯誤或污染的風(fēng)險。每個小瓶包含進(jìn)行20 μl RT-qPCR檢測所需的所有組分（除了引物和模板）。要執(zhí)行檢測，只需將小瓶用引物和RNA模板的混合物填充。

靈敏度：一般可以從10 pg至500 ng的polyA RNA或10 pg至1 μg的總RNA中檢測到目標(biāo)。即使是更少量的RNA，也可以通過使用高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本成功擴(kuò)增。

RT-qPCR檢測準(zhǔn)備：

1. RNA/引物混合物的準(zhǔn)備：將以下組分加入到無核酸酶的微管中，并通過輕輕上下移液進(jìn)行混合：

2. 變性和引物退火（可選）：請注意：對于表現(xiàn)出高度二級結(jié)構(gòu)的RNA靶標(biāo)、自互補(bǔ)或交叉互補(bǔ)的引物以及新靶標(biāo)的初始實驗，特別推薦樣本變性。對于許多標(biāo)準(zhǔn)的RNA和引物組合，即使省略熱處理也不會對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。將混合物在70°C下孵化5分鐘，然后放置在室溫下5分鐘。

3. 分配主混合物：向每個含有凍干粉的管子或板孔分配20微升(?l)的RNA/引物混合物。

逆轉(zhuǎn)錄和熱循環(huán)：將小瓶放入PCR循環(huán)儀中，并啟動以下程序。

1) 建議進(jìn)行10分鐘的逆轉(zhuǎn)錄時間，以獲得100至200堿基對(bp)之間的Z佳擴(kuò)增子長度。更長的擴(kuò)增子，達(dá)到500堿基對，可能需要延長孵化時間至15分鐘。每增加100堿基對，增加3分鐘。Z優(yōu)溫度取決于RNA的結(jié)構(gòu)特征。對于具有高二級結(jié)構(gòu)的難擴(kuò)增模板，將溫度提高到55°C。請注意，每個特定的RNA，應(yīng)調(diào)整Z優(yōu)的反應(yīng)時間和溫度。

2) 建議進(jìn)行5分鐘的初始變性時間，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

3) 退火溫度取決于所使用的引物和DNA探針的熔解溫度。

4) 延伸時間取決于擴(kuò)增子的長度。建議對1,000堿基對的片段進(jìn)行1分鐘的時間。為了獲得Z佳的特異性和擴(kuò)增效果，可能需要對推薦的參數(shù)進(jìn)行個別優(yōu)化。請注意，每個特定的RNA/引物對，應(yīng)調(diào)整Z優(yōu)的反應(yīng)時間和溫度。