cAMP是一種普遍存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的第二信使。這種信使調(diào)節(jié)各種激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其他配體受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。cAMP磷酸二酯酶是水解和截?cái)嘣醋允荏w激活的cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的唯一途徑。cAMP水解活性由一個(gè)相當(dāng)大的多酶家族提供，該家族具有獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)定位和調(diào)節(jié)特性。在各種PDE家族（PDE1-PDE11）中，PDE4有4個(gè)基因（PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D）以多剪接變體形式表達(dá)。

PDE4活性測(cè)量需要兩步反應(yīng)，在第一步反應(yīng)中，cAMP被PDE活性水解成非環(huán)狀。通過(guò)使PDE源變性或加入PDE4選擇性抑制劑來(lái)停止該反應(yīng)，然后通過(guò)第二步酶反應(yīng)將AMP轉(zhuǎn)化為腺苷達(dá)到平衡。由于腺苷是中性的，因此通過(guò)離子交換色譜法用電荷分離cAMP或AMP。為了避免其他PDE的背景貢獻(xiàn)，該P(yáng)DE測(cè)定在針對(duì)PDE4優(yōu)化的底物濃度下進(jìn)行。PDE4酶活性與第一反應(yīng)中形成的腺苷成正比。

PDE4活性測(cè)量在2-3小時(shí)內(nèi)提供可重復(fù)的結(jié)果。該試劑盒提供足夠的試劑，與內(nèi)部控制一起處理50或100個(gè)樣本。試劑盒試劑在推薦條件下儲(chǔ)存可穩(wěn)定6個(gè)月。該試劑盒的內(nèi)容物必須按照瓶子標(biāo)簽和規(guī)格表上的指示在不同溫度下儲(chǔ)存。

艾美捷FabGennix-PDEase試劑盒：

Incubation Buffer Reagent A   5 mL

Incubation Buffer Reagent B   5 mL

Incubation Buffer Reagent C   5 mL

PDE Substrate Buffer D10 mL

PDE Substrate   2X 200 ?l

Inhibitor Buffer   50 mL

Second Enzyme Source (10X)   2X 250 ?l

Resin Slurry (10X)   100 mL

Control PDE4 Enzyme   1x200 ?l

培養(yǎng)緩沖液的制備和檢測(cè)設(shè)置：

1孵育緩沖液必須在使用前立即混合儲(chǔ)備試劑來(lái)制備。

2將1.5毫升塑料圓錐管的成對(duì)排列放置在冰上，并使用鎖扣蓋密封。或者，可以使用16-18號(hào)針頭刺一個(gè)小孔，用于在后續(xù)步驟中產(chǎn)生的蒸汽排放。

3在每個(gè)放置在4°C冰上的圓錐管中，用移液管取25微升由孵育緩沖液試劑A、B和C混合制備的孵育緩沖液（A:B為3:1，C為1，體積比）。使用前立即制備此緩沖液。

4將PDE酶在孵育緩沖液中稀釋?zhuān)ú襟E2中制備），以獲得25微升孵育緩沖液中所需的PDE活性。通常細(xì)胞提取物中的25-50微克蛋白質(zhì)。

5在4°C下向孵育緩沖液中加入25微升PDE酶。

6向上述一系列管中加入5-10微升PDE酶源（2.5-7.5微克蛋白質(zhì)），并在4°C下孵育5分鐘。應(yīng)注意直接將酶滴入溶液中。所提供的部份純化的PDE4酶可以按5-10微升/測(cè)定使用。

7用新鮮的孵育緩沖液補(bǔ)充至25微升。保持所有管在4°C。

8在PDE底物緩沖液D中制備適當(dāng)濃度的抑制劑溶液，以獲得25微升中所需濃度。可以添加高達(dá)5%的DMSO而不影響試劑盒性能。其他溶劑的效果應(yīng)單獨(dú)測(cè)試。

9通過(guò)添加25微升Rolipram（在PDE底物緩沖液D中為100微米）可以確定對(duì)Rolipram敏感的PDE4活性。

10可以通過(guò)用相同體積替代Rolipram來(lái)篩選未知化合物對(duì)PDE4的抑制作用。

11在沒(méi)有任何抑制劑的情況下測(cè)量總PDE活性。抑制劑被25微升PDE底物緩沖液D替代，以測(cè)量總PDE活性。

12通過(guò)將100微升PDE底物與4885微升PDE底物緩沖液D和15微升2,8 3H-cAMP銨鹽（乙醇溶液，25-40 Ci/mmol；杜邦NEN公司提供）混合，為每次測(cè)定新鮮制備cAMP緩沖底物，并保持在冰上。

13管子應(yīng)標(biāo)記為放射性，并應(yīng)妥善處理放射性材料。

14將含有孵育緩沖液、酶源和抑制劑的圓錐管在30°C下預(yù)孵育5分鐘。

15加入50微升緩沖PDE底物（步驟5中制備）。

16將底物直接移液到孵育介質(zhì)中，并在30°C下?lián)u動(dòng)孵育10分鐘。重要的是要計(jì)時(shí)添加底物，因?yàn)橐坏┨砑拥孜铮复俜磻?yīng)就會(huì)開(kāi)始。保存剩余的底物溶液以測(cè)量總3H-CMP計(jì)數(shù)。將剩余的作為液體放射性廢物丟棄。

17在30°C下10分鐘后，立即將管子轉(zhuǎn)移到100°C水浴中3分鐘，以停止PDE反應(yīng)。管子可能因蒸汽產(chǎn)生而壓力增大，為了避免蓋子突然彈出，請(qǐng)?zhí)峁┻m當(dāng)?shù)耐L(fēng)或使用帶有點(diǎn)擊鎖定蓋子的管子。

18立即將管子轉(zhuǎn)移到冰上以冷卻反應(yīng)。此時(shí)可以停止測(cè)定，并將其存儲(chǔ)在4°C下進(jìn)行后續(xù)步驟。

將AMP轉(zhuǎn)化為腺苷并與AMP和cAMP分離

1通過(guò)將緩沖酶的濃溶液與蒸餾水按1:10稀釋來(lái)制備第二種酶溶液。保持在4°C。

2向每個(gè)管中加入25微升酶，并在30°C下孵育15分鐘。丟棄未使用的部分，這種酶在稀釋溶液中的活性不穩(wěn)定。

3向每個(gè)管中加入400微升預(yù)活化的離子交換樹(shù)脂。在移液過(guò)程中，樹(shù)脂漿應(yīng)該是均勻的；這可以通過(guò)使用小磁力攪拌棒不斷攪拌來(lái)實(shí)現(xiàn)。

4蓋緊并把所有管子渦旋30秒。

5將所有管子在冰上孵育15分鐘。

6將所有管子離心13,000轉(zhuǎn)/分鐘2分鐘。小心地轉(zhuǎn)移150微升上清液進(jìn)行3H β液體閃爍計(jì)數(shù)。保持閃爍液瓶在室溫下至少2小時(shí)后再進(jìn)行計(jì)數(shù)。將剩余的孵育混合物作為放射性廢物丟棄。剩余的放射性將在樹(shù)脂顆粒中。按照放射性處理剩余的管子，并將其作為固體放射性廢物丟棄。

7取相同量的放射性PDE4底物進(jìn)行總計(jì)數(shù)測(cè)量。

艾美捷科技是FabGennix的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。