一、Viability PCR(v-PCR，活力PCR ) 簡(jiǎn)介

可靠地檢測(cè)活微生物和病毒引起了眾多領(lǐng)域的廣泛興趣，包括基礎(chǔ)研究、食品安全、農(nóng)業(yè)和公共衛(wèi)生。然而，測(cè)量微生物活力的傳統(tǒng)方法依賴于耗時(shí)的培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)或顯微鏡觀察。此外，某些生物不能用當(dāng)前技術(shù)培養(yǎng)。因此，這些可行但不可培養(yǎng)的 (VBNC) 物種需要分子的生存能力測(cè)量。活力PCR (v-PCR) 是一種可靠且無需培養(yǎng)的方法，可靈敏且快速地檢測(cè)微生物的活力。自2006 年以來，Biotium通過開發(fā)PMA(單疊氮化丙錠)和改進(jìn)的PMAxx v-PCR染料開創(chuàng)了v-PCR領(lǐng)域，通過 qPCR 選擇性檢測(cè)活細(xì)菌方面非常有用。

使用PMA和PMAxx 的v-PCR的優(yōu)勢(shì)：

無需耗時(shí)的培養(yǎng)、顯微鏡檢查或菌落計(jì)數(shù)即可進(jìn)行靈敏且快速的生存力分析；

允許進(jìn)行菌株特異性生存力分析；

已針對(duì)數(shù)十種細(xì)菌、真菌和病毒物種進(jìn)行驗(yàn)證和發(fā)布；

與下一代測(cè)序應(yīng)用兼容；

適用于復(fù)雜樣品類型，包括土壤、糞便、水/廢水、生物標(biāo)本和食品；

v-PCR 的行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者

PMA是行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者首選的v-PCR 染料，并已在數(shù)百份同行評(píng)審的論文和大量細(xì)菌、真菌和病毒菌株中得到驗(yàn)證。早期研究側(cè)重于細(xì)菌中的v-PCR，驗(yàn)證了在數(shù)十種不同細(xì)菌菌株中的程序，例如大腸桿菌、李斯特菌、軍團(tuán)菌、乳酸桿菌、結(jié)核分枝桿菌、衣原體、幽門螺桿菌以及許多其他與人類健康相關(guān)的菌株. v-PCR 在細(xì)菌中的應(yīng)用最為廣泛，但也有許多引文在酵母和真菌、病毒以及各種其他細(xì)胞類型（如古生菌、變形蟲和寄生蟲）中使用 v-PCR。

二、已驗(yàn)證的Viability PCR應(yīng)用實(shí)例：

微生物組研究

環(huán)境測(cè)試

益生菌研究

臨床測(cè)試

食品和水衛(wèi)生

葡萄酒發(fā)酵

微生物測(cè)序

1. 測(cè)量環(huán)境樣品中細(xì)菌的活力

在本文中，我們選擇了三篇關(guān)于v-PCR與PMA和PMAxx 引文介紹了如何用v-PCR監(jiān)測(cè)廢水、淡水和飲用水處理廠采集的樣本中的細(xì)菌活力。

2. 用PMA或PMAxx 研究病毒完整性

v-PCR是一種已被證實(shí)的監(jiān)測(cè)數(shù)十種病毒株衣殼完整性的方法，包括嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型。

下圖顯示了過去十年（2009年至2021年）在食品安全和環(huán)境病毒學(xué)領(lǐng)域的同行評(píng)審研究中，使用v-PCR監(jiān)測(cè)衣殼完整性所調(diào)查的病毒屬和株數(shù)。

在本文中我們選擇了三份引文，其中包含關(guān)于PMA或PMAxx 如何與qPCR相結(jié)合，來靈敏、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)完整的病毒衣殼。

三、V-PCR的工作原理

下面的信息圖顯示了v-PCR的基本機(jī)制，PMAxx 和PMA是對(duì)DNA具有高親和力的光活性染料。染料插入dsDNA并在暴露于強(qiáng)烈可見光時(shí)形成共價(jià)鍵。該反應(yīng)通過在純化過程中去除修飾的DNA和通過DNA聚合酶抑制模板擴(kuò)增的組合來抑制修飾的DNA模板的PCR擴(kuò)增。由于染料是細(xì)胞膜不可滲透的，當(dāng)用染料處理含有活細(xì)菌和死細(xì)菌的樣品時(shí)，只有細(xì)胞膜受損的死細(xì)菌才容易受到DNA修飾。在qPCR反應(yīng)中，死細(xì)胞DNA將顯示出延遲擴(kuò)增和比活細(xì)胞更高的Ct。

活性PCR染料，如PMAxx 或PMA是膜不滲透的，這使它們具有死細(xì)胞特異性。一旦進(jìn)入死細(xì)胞，它們就會(huì)與DNA結(jié)合。暴露在強(qiáng)烈的可見光下會(huì)使染料具有活性，并使它們共價(jià)附著在DNA上，這種DNA修飾防止了隨后的PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增。

v-PCR工作流程：

v-PCR的基本工作流程如下圖所示（詳細(xì)協(xié)議可在產(chǎn)品頁面上找到）。它適用于許多不同的樣本類型和實(shí)驗(yàn)設(shè)置。對(duì)于少量培養(yǎng)物，樣品可以在微型離心管中制備，并在PMA-Lite 2.0 LED光解裝置中暴露在光下。

許多出版物已經(jīng)將基本協(xié)議的修改用于特殊應(yīng)用。例如，對(duì)于大的稀釋體積，可以將樣品過濾到膜上，然后對(duì)膜本身進(jìn)行染料處理和光解。不透明、復(fù)雜的樣品，如土壤或糞便，通常需要更高的染料濃度和更長(zhǎng)的光照時(shí)間；樣品稀釋也有幫助。一些用戶選擇直接對(duì)細(xì)菌裂解物進(jìn)行qPCR，而不是首先純化DNA。

基本的v-PCR工作流程包括以下5個(gè)步驟：染料添加、培養(yǎng)、光照、DNA提取和qPCR。

四、PMA & PMAXX V-PCR 染料

PMA在數(shù)百篇針對(duì)各種菌株的期刊文章中得到驗(yàn)證

自Biotium首次開發(fā)PMA以來，已有數(shù)百篇關(guān)于染料在許多樣品類型中的應(yīng)用的出版物，包括數(shù)十種細(xì)菌菌株、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核細(xì)胞。它已用于食品和水安全以及環(huán)境測(cè)試等應(yīng)用，并已與qPCR、NextGen測(cè)序(NGS)、Sanger測(cè)序和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP) 結(jié)合使用。

PMAxx 是PMA的卓越替代品

雖然PMA通常可通過qPCR有效區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌，但它并不能完全消除死細(xì)胞DNA中的PCR產(chǎn)物。這可能會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果。PMAxx 由Biotium科學(xué)家設(shè)計(jì)，旨在成為PMA的卓越替代品。PMAxx 在消除死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增方面更有效，因此可以最好地區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌。

相關(guān)產(chǎn)品推薦：

Viability PCR入門套件

可定制的 Viability PCR 入門套件包含使用 PMA 或 PMAxx 活力染料和 qPCR 選擇性檢測(cè)活細(xì)胞所需的材料。這些試劑盒可用于您選擇的任何細(xì)胞類型（有關(guān)已發(fā)布的經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)胞類型，請(qǐng)參閱PMA/PMAxx 參考列表和經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)菌菌株列表）。所有試劑盒均包含 Forget-Me-Not EvaGreenqPCR Master Mix，以及您選擇的 PMA 或 PMAxx 染料。您還可以選擇帶有或不帶有革蘭氏陰性細(xì)菌增強(qiáng)劑（不適用于其他細(xì)胞類型）的試劑盒。用戶將需要提供自己的引物來擴(kuò)增他們感興趣的物種（請(qǐng)參閱此 博客文章 用于引物設(shè)計(jì)考慮）。每個(gè)試劑盒包含的試劑足以處理 80 種細(xì)菌培養(yǎng)物并進(jìn)行200次PCR反應(yīng)。

試劑盒包括：

PMA 染料或 PMAxx 染料

Forget-Me-Not EvaGreen qPCR預(yù)混液

ROX 參考染料

PMA 增強(qiáng)劑（僅限革蘭氏陰性菌株）

不包括但需要：

用于擴(kuò)增您感興趣的細(xì)胞類型的引物

DNA 提取試劑盒或試劑

相關(guān)產(chǎn)品推薦：

PMA增強(qiáng)劑

PMA Enhancer for Gram Negative Bacteria 旨在提高活力PCR期間對(duì)活的革蘭氏陰性菌和死的革蘭氏陰性菌的區(qū)分。PMA增強(qiáng)劑以5X溶液的形式提供，并在添加活性染料之前添加到樣品中。當(dāng)來自革蘭氏陰性細(xì)菌的序列通過PCR擴(kuò)增時(shí)，用增強(qiáng)劑預(yù)處理的樣品顯示來自死細(xì)胞的信號(hào)減少，而來自活細(xì)胞的信號(hào)沒有變化。PMA Enhancer 與 PMAxx 和 PMA兼容。PMAxx plus Enhancer是對(duì)革蘭氏陰性菌進(jìn)行活力PCR的最佳方式。PMA Enhancer可作為獨(dú)立產(chǎn)品使用，也是我們 PMA 細(xì)菌活力試劑盒（僅限革蘭氏陰性菌株）的組成部分（見下文）。

增強(qiáng)劑改善活/死區(qū)分的機(jī)制尚未確定。它可以提高死細(xì)胞壁或膜對(duì)染料的被動(dòng)滲透性，以及提高染料與死細(xì)胞DNA的接觸。

革蘭氏陰性菌PMA增強(qiáng)劑相關(guān)產(chǎn)品推薦：

五、光活化裝置PMA-Lite

PMA-Lite LED 光解裝置允許對(duì)微量離心管中經(jīng) PMAxx 或PMA處理的樣品進(jìn)行時(shí)間和溫度控制的光處理。

PMA-Lite 的特點(diǎn)：

為多達(dá)18個(gè)微量離心管提供均勻照明

內(nèi)部風(fēng)扇保持溫度< 37°C

曝光時(shí)間為10、15、20 或 30 分鐘的四種定時(shí)器設(shè)置

發(fā)射波長(zhǎng)為465-475 nm的耐用LED燈

使用 PMAxx 染料可獲得最佳效果

六、菌株特異性 V-PCR 試劑盒

菌株特異性v-PCR 試劑盒設(shè)計(jì)用于使用PMAxx 或PMA染料和實(shí)時(shí) PCR 選擇性檢測(cè)來自特定菌株的活細(xì)菌。該試劑盒包含PMA染料或PMAxx 染料、Forget-Me-Not EvaGreen qPCR 預(yù)混液和經(jīng)過驗(yàn)證的 PCR 引物，用于檢測(cè)對(duì)食品安全、公共衛(wèi)生和/或抗菌研究具有廣泛意義的選定細(xì)菌菌株。

Kit組分包括：

PMA 染料或 PMAxx 染料

Forget-Me-Not EvaGreen qPCR預(yù)混液

ROX 參考染料

PMA 增強(qiáng)劑（僅限革蘭氏陰性菌株）

針對(duì)特定細(xì)菌菌株的經(jīng)驗(yàn)證的 PCR 引物

PMA實(shí)時(shí)PCR細(xì)菌活力試劑盒可用于鑒定如下菌株：

腸道沙門氏菌

結(jié)核分枝桿菌

金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（耐甲氧西林）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

大腸桿菌

大腸桿菌 O157:H7

嗜肺軍團(tuán)菌

菌株特異性細(xì)菌活力 PCR 試劑盒：