大多數(shù)情況下，工程核酸酶的靶向效率在1%~30%之間。盡管與通過同源重組的傳統(tǒng)基因靶向技術相比，這種效率相當明顯，但分離攜帶所需突變的細胞的步驟仍然需要廣泛的篩選。

PNA Bio開發(fā)的敲除細胞富集系統(tǒng)就是為了克服這些限制。使用替代報告子可以選擇性富集在靶位點獲得EN介導突變的細胞。

替代報告基因由編碼通過EN靶向序列連接的兩種熒光蛋白（紅色和綠色）的基因組成。在沒有EN表達的情況下，它們被設計為表達紅色而不是綠色熒光蛋白，因為它被放置在框架外。ENs表達后，可誘導GFP前靶位點的雙鏈斷裂，導致移碼突變和GFP表達。綠色GFP的表達嚴格依賴于特異性識別報告構建體中靶序列的ENs的核酸酶活性的存在。

PNA Bio的代理報告系統(tǒng)是一個很好的工具，可以通過基因編輯事件來可視化和豐富細胞。使用替代報告子系統(tǒng)，可以將發(fā)現(xiàn)敲除細胞的頻率提高3～20倍。

艾美捷PNA Bio-替代報告系統(tǒng)：

GFP系統(tǒng)：mRFP（組成性表達）+ EN靶向位點 + GFP1（錯位）+ GFP2（錯位）

MACS系統(tǒng)：mRFP（組成性表達）+ EN靶向位點 + GFP（錯位）+ 跨膜蛋白（錯位）

HygR系統(tǒng)：mRFP（組成性表達）+ EN靶向位點 + GFP（錯位）+ 潮霉素抗性基因（錯位）

時間線：2周

左圖：將不同量的Cas9蛋白與500ngsgRNA孵育。通過脂質體胺將RNP復合物轉染到NIH3T3細胞中。24小時后，從每種條件下制備DNA用錯配敏感核酸酶法（T7E1）檢測Cas9蛋白和sgRNA的活性。

右圖：對于體內成像，通過以下方法將500ng的Cas9蛋白和500ng的sgRNA轉染到NIH3T3細胞lipofectamine。24小時后，通過共焦顯微鏡對細胞進行再成像顯微鏡。

Cy3-Cas9蛋白的活性通過電穿孔進入細胞，然后進行T7E1測定來確認。熒光通過共聚焦顯微鏡確認。

PNA Bio-Cas9共轉染/選擇載體：

CV02：Cas9、潮霉素抗性基因(Hygro R)和GFP（由CMV啟動子驅動）

CV03：Cas9、紅色熒光蛋白(RFP)和嘌呤霉素抗性基因(Puro R)（由CMV啟動子驅動）

CV12：Cas9、潮霉素抗性基因(Hygro R)和GFP（由EF1a啟動子驅動）

CV13：Cas9、紅色熒光蛋白(RFP)和嘌呤霉素抗性基因(Puro R)（由EF1a啟動子驅動）

文獻參考：

1.Surrogate reporters for enrichment of cells withnuclease-induced mutations. KimH et al.  (2011) Nat Meth 8:941-943.

2.Magnetic separation and antibiotics selection enable enrichmentof cells with ZFN/TALEN-induced mutations. Kim H et al. (2013) PLosOne 8(2):e56476.

3.Surrogate reporter-basedenrichment of cells containing RNA-guided Cas9 nuclease-induced mutations. Ramakrishna S et al. (2014) Nat Comm 5: 3378

艾美捷科技是PNA Bio的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質的產(chǎn)品與服務。