一、研究背景

DNA損傷是細(xì)胞在環(huán)境因素（如紫外線、化學(xué)誘變劑）及自身代謝過(guò)程（如氧化磷酸化產(chǎn)生的活性氧）雙重作用下持續(xù)發(fā)生的分子事件。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞每天約發(fā)生1000至100萬(wàn)次DNA損傷事件。盡管這一數(shù)字相對(duì)于人類基因組約60億個(gè)堿基的總量而言比例甚低，但若關(guān)鍵基因（如抑癌基因、DNA修復(fù)基因）上的損傷未能被及時(shí)正確修復(fù)，將導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，顯著增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

彗星檢測(cè)，亦稱單細(xì)胞凝膠電泳，是目前評(píng)估單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度最常用的技術(shù)之一。其原理是：在電場(chǎng)作用下，含有鏈斷裂或堿基損傷的DNA片段因分子量較小、負(fù)電荷較多，會(huì)從細(xì)胞核中遷移出來(lái)，與完整DNA分離，經(jīng)DNA熒光染料染色后，在顯微鏡下呈現(xiàn)形似“彗星”的拖尾圖像。研究人員通常通過(guò)測(cè)量彗尾長(zhǎng)度、尾部DNA百分比及尾矩等參數(shù)對(duì)DNA損傷進(jìn)行定量分析。

二、產(chǎn)品概述與檢測(cè)原理

由艾美捷代理Cell Biolabs公司推出的OxiSelect 48孔彗星檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：STA-845），是一種快速、靈敏的細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)方案。每套試劑盒可完成48次檢測(cè)（48孔專用玻片一塊），適用于藥物篩選、環(huán)境毒理學(xué)評(píng)價(jià)及DNA修復(fù)機(jī)制研究。

檢測(cè)原理（堿性彗星檢測(cè)流程）：

1. 細(xì)胞包埋：將待測(cè)單細(xì)胞懸液與熔融的低熔點(diǎn)瓊脂糖按比例混合，迅速加樣至48孔彗星檢測(cè)專用玻片的各孔中，4℃凝固，使細(xì)胞固定于瓊脂糖凝膠微環(huán)境內(nèi)。

2. 裂解與解旋：加入裂解緩沖液（含高濃度鹽和去垢劑）去除細(xì)胞膜、胞漿蛋白及核膜，暴露核DNA；隨后用堿性溶液處理，使DNA雙鏈解旋變性，并將DNA單鏈斷裂和雙鏈斷裂轉(zhuǎn)化為可遷移的單鏈缺口。

3. 電泳：在水平電泳槽中進(jìn)行堿性電泳（推薦條件：33 V，300 mA，15分鐘）。受損DNA片段因其分子量小、帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中遷移距離長(zhǎng)；完整DNA因分子量大、超螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)雜，遷移距離短。

4. 染色與觀察：電泳結(jié)束后，干燥玻片，用DNA染料（如Vista Green）染色，通過(guò)熒光顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)約490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)約520 nm）觀察并采集圖像。受損細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“彗星”形態(tài)，拖尾長(zhǎng)度和尾部熒光強(qiáng)度與DNA損傷程度正相關(guān)。

三、試劑盒組分與儲(chǔ)存

試劑盒在室溫下運(yùn)輸，各組分及儲(chǔ)存要求如下：

組分名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存條件

48孔彗星檢測(cè)專用玻片 | STA-846 | 1塊（48孔） | 室溫

彗星瓊脂糖（無(wú)菌） | 235002 | 15 mL瓶 | 室溫

Vista Green DNA染料（10000×） | 235003 | 5 ?L管 | -20℃

EDTA溶液（500 mM） | 235004 | 50 mL瓶 | 室溫

10×裂解液 | 235005 | 20 mL瓶 | 室溫

用戶自備材料：

NaCl粉末、NaOH顆粒、10 N NaOH（用于pH調(diào)節(jié)）

DMSO（可選）、70%乙醇

TE緩沖液（10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA）

PBS（不含Mg??和Ca??）、去離子水

EDTA（二鈉鹽）

四、試劑配制方法

1. 彗星瓊脂糖的液化

將瓊脂糖瓶置于90-95℃水浴中加熱20分鐘，直至瓊脂糖完全熔融。隨后轉(zhuǎn)移至37℃水浴中平衡20分鐘，并保持于37℃待用（避免提前凝固）。注意：加熱時(shí)瓶蓋應(yīng)略微旋松以防爆裂，液化后不可重新加熱。

2. Vista Green DNA染液（1×）

將10000×濃縮染料用TE緩沖液按1:10000比例稀釋（例如：5 ?L染料 + 50 mL TE緩沖液）。染液可在4℃避光保存3周。該染料靈敏度高，使用前應(yīng)充分混勻，避免反復(fù)凍融。

3. 1×裂解液（以配制100 mL為例）

組分 | 終濃度 | 加入量

10×裂解液 | 1× | 10 mL

NaCl | 2.5 M | 14.6 g

EDTA（自備） | 100 mM | 3.72 g

去離子水 | — | 補(bǔ)至100 mL

配制步驟：稱取NaCl和EDTA，加入約80 mL去離子水溶解；再加入10 mL 10×裂解液，攪拌至完全溶解；用去離子水定容至100 mL。調(diào)節(jié)pH至10.0（使用10 N NaOH）。若實(shí)驗(yàn)需要抑制核酸酶活性，可臨用前加入DMSO至終濃度10%。

五、結(jié)果計(jì)算與分析

DNA損傷通過(guò)測(cè)量細(xì)胞核遺傳物質(zhì)（彗頭）與遷移產(chǎn)物（彗尾）之間的位移進(jìn)行定量。最常用的兩個(gè)參數(shù)為尾部DNA百分比和尾矩。建議每個(gè)樣本至少分析50-100個(gè)細(xì)胞，以獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3：彗星實(shí)驗(yàn)中的典型受損DNA。

Tail DNA% = 100 x Tail DNA Intensity/CellDNA IntensityTail Moment can be measured using one of thefollowing methods:

(a) Olive Tail Moment = Tail DNA% x TailMoment Length*

(b) Extent Tail Moment = Tail DNA% x Length ofTail (見(jiàn)上圖)

A number of Comet Assay analysis softwareprograms are commercially available, such as andComet Assay IV (Perceptive Instruments) andCASPlab.

*Tail Moment Length is measured from the centerof the head to the center of the tail (see Figure 3)

六、相關(guān)產(chǎn)品信息

如需更高或更低通量，可選用以下同系列產(chǎn)品：

DNA雙鏈斷裂染色試劑盒 | STA-321

氧化性DNA損傷定量試劑盒（AP位點(diǎn)） | STA-324

3孔彗星檢測(cè)試劑盒 | STA-350 | 15次檢測(cè)

24孔彗星檢測(cè)試劑盒 | STA-835 | 24次檢測(cè)

96孔彗星檢測(cè)試劑盒 | STA-855 | 96次檢測(cè)

七、注意事項(xiàng)

1. Vista Green DNA染料需嚴(yán)格儲(chǔ)存于-20℃，其他組分室溫保存即可。染色液配制后應(yīng)在3周內(nèi)使用。

2. 低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞混合前需冷卻至37℃左右，以免熱損傷細(xì)胞。

3. 電泳條件（電壓、電流、時(shí)間）應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和預(yù)期損傷程度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。圖示結(jié)果（依托泊苷處理Jurkat細(xì)胞）僅供參考。

4. 實(shí)驗(yàn)全程應(yīng)避光操作（特別是染色后），防止熒光淬滅。

5. PBS必須不含Mg??和Ca??，否則可能影響瓊脂糖凝固及細(xì)胞包埋效果。

文獻(xiàn)參考：

1. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984). Micro gel electrophoretic study of radiation induced DNAdamages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291–298.

2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., and Schneider, E. L. (1988). A simple technique forquantification of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell. Res. 175, 184–191.

3. Olive, P. L., Banath, J. P., and Durand, R. E. (1990a). Heterogeneity in radiation induced DNAdamage and repair in tumor and normal cells using the "Comet" assay. Radiat. Res. 122, 86–94.4. De Boeck, M., Touil, N., De Visscher, G., Vande, P. A., and Kirsch-Volders, M. (2000). Validationand implementation of an internal standard in Comet assay. Mutat. Res. 469, 181–197.