DNA損傷是細胞在環(huán)境因素（如紫外線、化學誘變劑）及自身正常代謝過程（如氧化呼吸鏈產生的活性氧）共同作用下持續(xù)發(fā)生的分子事件。據(jù)統(tǒng)計，每個細胞每天約發(fā)生1000至100萬次DNA損傷事件。雖然這一數(shù)字相對于人類基因組約60億個堿基的總量而言占比甚微，但若關鍵基因上的損傷未能被及時正確修復，將阻礙細胞正常功能，并顯著增加癌變風險。

目前已有多種方法用于檢測DNA損傷，其中彗星檢測（單細胞凝膠電泳）是應用最廣泛的技術之一。在電場作用下，受損DNA（含碎片和鏈斷裂）與完整DNA分離，在顯微鏡下呈現(xiàn)經(jīng)典的“彗星拖尾”形態(tài)。然而，Sestili和Cantoni（參考文獻1）開發(fā)了一種新型單細胞檢測技術——堿性暈圈法。該方法無需電泳步驟，而是利用損傷DNA片段在堿性低滲緩沖液中通過瓊脂糖凝膠孔徑的徑向擴散，且擴散距離與DNA片段大小呈反比。“暈圈”一詞描述了損傷DNA從分離的細胞核中徑向擴散后形成的形態(tài)。

與彗星檢測相比，堿性暈圈法具有操作更簡單、更快速的優(yōu)點（盡管彗星檢測在靈敏度上仍略勝一籌）。艾美捷代理Cell Biolabs公司推出的OxiSelect堿性暈圈檢測試劑盒（貨號：STA-890）是一種快速、靈敏的細胞DNA損傷檢測方案，每套試劑盒可完成15次檢測。

一、檢測原理

OxiSelect堿性暈圈檢測試劑盒是一種基于單細胞水平的DNA損傷檢測方法，其原理與操作流程如下：

1. 細胞包埋：將待測單細胞懸液與熔融的暈圈專用瓊脂糖按比例混合，迅速加樣至OxiSelect暈圈檢測專用玻片（3孔規(guī)格）的各孔中，4℃凝固，使細胞固定于瓊脂糖凝膠微環(huán)境內。

2. 裂解與堿性擴散處理：包埋后的細胞加入暈圈擴散緩沖液和堿性溶液進行處理。該緩沖液為低滲堿性體系，可破壞細胞膜和核膜，釋放出細胞核；同時，堿性條件使DNA雙鏈解旋變性，并將DNA鏈斷裂轉化為可遷移的單鏈缺口。在此條件下，受損DNA片段因其分子量較小，能夠通過瓊脂糖凝膠的孔隙發(fā)生滲透性徑向擴散；而完整DNA由于分子量大、超螺旋結構復雜，擴散能力極弱。

3. 暈圈形成與觀察：經(jīng)過堿性擴散處理后，損傷DNA從細胞核中心向四周擴散，形成環(huán)形的“暈圈”形態(tài)（見圖1）。用Vista Green DNA染料染色后，在熒光顯微鏡下可清晰觀察到：未損傷細胞核呈致密的圓形熒光點，無暈圈或暈圈極窄；損傷程度越高的細胞，暈圈直徑越大，邊緣熒光越彌散。

4. 結果量化：通過計算核擴散因子對每個樣本的DNA損傷程度進行定量。核擴散因子的計算方法通常為：（暈圈直徑）/（核直徑），或通過圖像分析軟件測量暈圈面積與核面積的比值。建議每個樣本至少分析50個細胞。

二、試劑盒組分與儲存

試劑盒在室溫下運輸，各組分及儲存要求如下：

組分名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存條件

3孔堿性暈圈檢測專用玻片 | STA-892 | 5塊（共15孔） | 室溫

暈圈瓊脂糖（無菌） | 289001 | 15 mL瓶 | 室溫

10×暈圈擴散緩沖液 | 289002 | 20 mL瓶 | 室溫

EDTA溶液（500 mM） | 235004 | 50 mL瓶 | 室溫

10×暈圈堿性溶液 | 289003 | 20 mL瓶 | 室溫

Vista Green DNA染料（10000×） | 235003 | 5 uL管 | -20℃ |

儲存注意事項：收到試劑盒后，Vista Green DNA染料應立即轉移至-20℃保存；其他所有組分室溫保存即可。染液應避免反復凍融，長期不用時建議分裝保存。

三、操作流程要點

1. 細胞準備：收集待測細胞（推薦密度為1-5×105 cells/mL），用不含Mg2+和Ca2+的PBS洗滌一次。

2. 包埋：將細胞懸液與37℃預熱的暈圈瓊脂糖按1:10（體積比）混合，立即吸取50-100 uL滴加至玻片各孔中，4℃凝固10分鐘。

3. 裂解與擴散：每孔加入預冷的1×暈圈擴散緩沖液（含堿性溶液），4℃孵育20-30分鐘。

4. 中和與固定：用去離子水輕輕洗滌玻片，再用70%乙醇固定5分鐘。

5. 染色：加入1×Vista Green DNA染液，室溫避光染色15分鐘。

6. 觀察與分析：在熒光顯微鏡下（激發(fā)波長約490 nm，發(fā)射波長約520 nm）觀察并采集圖像。使用圖像分析軟件測量核直徑和暈圈直徑，計算核擴散因子。

四、結果示例

圖: H2O2處理293細胞。在進行堿性鹵素試驗前，293細胞未處理（上圖）或用1mM H2O2處理30分鐘

五、相關產品

OxiSelect 氧化性DNA損傷ELISA試劑盒 | STA-320 | 8-OHdG定量

OxiSelect DNA雙鏈斷裂染色試劑盒 | STA-321 | 雙鏈斷裂檢測

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OxiSelect 彗星檢測試劑盒（3孔玻片） | STA-350 | 15次檢測

六、注意事項

1. 操作簡便性：堿性暈圈法的最大優(yōu)勢在于無需電泳設備，僅需常規(guī)水浴、冰箱和熒光顯微鏡即可完成，適合實驗室條件有限或需要快速初篩的場景。

2. 靈敏度對比：雖然堿性暈圈法操作更簡便，但彗星檢測對低水平DNA損傷的靈敏度更高。對于需要高靈敏度的研究，建議優(yōu)先考慮彗星檢測；對于藥物篩選等需要高通量、快速比較的實驗，堿性暈圈法是理想選擇。

3. 染色保護：Vista Green DNA染料為光敏性物質，染色后應盡快在熒光顯微鏡下觀察和拍照，避免長時間光照導致熒光淬滅。

4. 瓊脂糖溫度控制：瓊脂糖與細胞混合前必須冷卻至37℃左右，溫度過高會導致細胞熱損傷，溫度過低則瓊脂糖提前凝固，無法均勻包埋。

5. 緩沖液新鮮配制：堿性擴散緩沖液應現(xiàn)用現(xiàn)配，長時間放置會導致pH漂移，影響DNA解旋效率。

文獻參考：

1. Sestili P., and Cantoni O. (1999) Free Radic. Biol. Med. 26, 1019-1026.

2. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984). Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291–298.

3. Sestili P., Martinelli C., and Stocchi V.? (2006) Mutat Res 607, 205–214.