基礎(chǔ)知識(shí)背景 — 什么是小G蛋白？  

 

       小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有20—30KD而得名，同時(shí)具有GTP酶活性，小G蛋白家族成員在細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮分子開關(guān)的功能，參與調(diào)控很多生物學(xué)過(guò)程。小G蛋白的共同特點(diǎn)是，當(dāng)結(jié)合了GTP時(shí)即成為活化形式，這時(shí)可作用于下游分子使之活化，而當(dāng)GTP水解成為GDP時(shí)（自身為GTP酶）則恢復(fù)到非活化狀態(tài)。這一點(diǎn)與G蛋白里的Gα類似，但是小G蛋白的分子量明顯低于Gα。

 

       在細(xì)胞中存在著一些專門控制小G蛋白活性的小G蛋白調(diào)節(jié)因子，有的可以增強(qiáng)小G蛋白的活性，如鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鳥苷酸解離抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。

 

 

      第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的產(chǎn)物。小G蛋白的Ras超家族由超過(guò)150個(gè)成員組成，基于它們的序列同源性，被分成若干亞家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。  

 

      小G蛋白超家族成員及其相關(guān)功能：

 

 

      Ras蛋白主要參與細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；Rho蛋白對(duì)細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；Rab蛋白則參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膜交通（membrane traffic），其他家族成員也在細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮著非常重要的作用。

       因此，研究GTP酶（GTPase）的活化調(diào)控機(jī)制具有廣泛而深遠(yuǎn)的生物學(xué)意義。

       傳統(tǒng)檢測(cè)Rho 蛋白活化水平的方法主要為pull-down檢測(cè)。pull-down法往往存在耗時(shí)長(zhǎng)、需要樣本量大、不太適合高通量檢測(cè)等缺點(diǎn)。為克服傳統(tǒng)方法這些方面的缺點(diǎn)，Cytoskeleton公司開發(fā)了新一代的G-LISA™檢測(cè)方法，用于快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)GTP酶活化水平。

   

      G-LISA實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟  

 

 

      1.首先將效應(yīng)蛋白的受體結(jié)合域（RBD）包被96孔板；

      2.樣本中GTP(活化狀態(tài))結(jié)合形式的蛋白分子則可結(jié)合到板上，而GDP(無(wú)活性狀態(tài))結(jié)合形式蛋白則不結(jié)合；

      3.洗去未結(jié)合的蛋白；

      4.然后依次加入特異性的一抗和HRP-二抗進(jìn)行孵育結(jié)合；

      5.最后利用合適的酶底物OPD或化學(xué)發(fā)光試劑顯色。

 

Swiss 3T3 細(xì)胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）

 

      傳統(tǒng)Pull down法和G-LISA法的比較

 

 

      G-LISA法對(duì)比傳統(tǒng)的pull down，主要有操作簡(jiǎn)便、上樣量少、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本、反應(yīng)時(shí)間短、定量結(jié)果準(zhǔn)確、與小鼠、大鼠和人的組織和細(xì)胞兼容等優(yōu)勢(shì)。  

 

      小G蛋白活化檢測(cè)試劑盒Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：

 

 

      Lanes 4 & 5:10 ng/ ml of EGF， 2min

      Lanes 2 & 3: Persistent serum starvation

      Lanes 1: 20 ng of recombinant Rac1-His protein run as a western blot standard  

 

      小G蛋白活化檢測(cè)試劑盒G-LISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：

 

  分別用CN01（藍(lán)色Activators）和LPA（紅色）處理后RhoA的活化進(jìn)程  

 

      已發(fā)表精彩文章賞析:

 

      （1）M.L. Schultz et al. 2014. CLN3 deficient cells display defects in the Arf1-Cdc42 pathway and actin-dependent events. PLoS ONE. 9: e96647.  (Cat. # BK132)  

 

 

Figure 7. The impact of ARHGAP21 overexpression on endocytosis.

 

 

      (A) Cln3^−/− and Cln3^R MBECs were transfected with GFP, WT-Cdc42, dominant negative Cdc42 (DN-Cdc42), or ARHGAP21 expressing plasmids and Cdc42-GTP levels measured. (B) MBECs were transfected with GFP negative control, WT-Cdc42, or ARHGAP21(GAP21) constructs and rhodamine-conjugated dextran uptake was assessed as in Fig. 2. Results represent the mean of three independent experiments.  

 

Figure8. ARF1-GTP is reduced in CLN3-null MBECs.

 

       (A) ARF1-GTP levels were quantified in Cln3^R and Cln3^−/− MBEC lysates. (B) Total ARF1 protein levels were quantified in Cln3^R and Cln3^−/− MBEC lysates by western blot, expressed as band intensity normalized to the actin loading control. Data represent the mean of (A) five and (B) three independent experiments.  

 

      （2）M.J. Herr et al., 2014. Tetraspanin CD9 regulates cell contraction and actin arrangement via RhoA in human vascular smooth muscle cells. PLoS ONE. 9:e106999.   (Cat. # BK124)  

 

 

      Figure 4. Activation of RhoA restores the contractile capabilities of CD9 shRNA HAOSMC and partially restores actin arrangement.  

 

      A and B, GTP-bound (active) and total RhoA was quantitated using whole cell lysates of Ctr shRNA HAOSMC or CD9 shRNA HAOSMC treated with the RhoA activator CN03 (2.0 µg/ml) for two h (n = 3; NS = not significant; **P<0.01). C and D, CD9 shRNA cells were treated with CN03 (2.0 µg/ml) for two h prior to releasing the sides of a collagen gel contraction assay. A representative image of a collagen gel contraction taken at 6 h and quantification of collagen gel contraction from 0-6h is shown (n = 3/time point). E, A representative immunofluorescent stained image of f-actin arrangement from three independently repeated experiments in untreated Ctr shRNA and CD9 shRNA treated with 2.0 µg/ml of CN03 for two h (scale bar, 50 µm). F, Actin filament length was quantified using ImageJ analysis software (n = 15 cells; *P<0.05).  

 

      Cytoskeleton提供的小G蛋白活化檢測(cè)試劑盒：

 

 

       Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學(xué)和細(xì)胞過(guò)程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發(fā)與生產(chǎn)。公司提供藥物篩選、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM）、細(xì)胞骨架研究相關(guān)的系列試劑盒和產(chǎn)品，尤其以細(xì)胞骨架相關(guān)研究見長(zhǎng)，既能滿足于樣品較少的科學(xué)研究，也可以用于小規(guī)模篩選研究和高通量大規(guī)模篩選研究。目前主要的產(chǎn)品有340余種，其產(chǎn)品主要覆蓋肌動(dòng)蛋白，微管蛋白，馬達(dá)蛋白，小G蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)，活細(xì)胞成像等相關(guān)領(lǐng)域，提供對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，抗體，檢測(cè)與分析試劑盒，并且產(chǎn)品線還在不斷的擴(kuò)大中。此外，公司還提供微管蛋白，肌動(dòng)蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現(xiàn)有產(chǎn)品的藥物篩選服務(wù)。  

 

      作為Cytoskeleton在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技有限公司將為中國(guó)客戶提供最全面的Cytoskeleton產(chǎn)品以及訂制服務(wù)。