泛素為含76個氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白質(zhì)、大小約為8.6 kDa，在蛋白質(zhì)降解和細胞信號傳導(dǎo)中起著重要作用。泛素具有7個賴氨酸殘基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)和一個甲硫氨酸殘基(M1)，泛素之間主要通過賴氨酸殘基和甲硫氨酸殘基進行各種連接，由此產(chǎn)生的泛素鏈產(chǎn)生一定的拓撲結(jié)構(gòu),可通過對蛋白底物進行修飾并決定底物的功能。泛素可以通過其C-末端與靶蛋白上的賴氨酸殘基的胺基團結(jié)合。這種結(jié)合被稱為單一泛素化。額外的泛素基團可以通過泛素中的七個賴氨酸殘基之一與初始泛素結(jié)合。這些泛素鏈的形成被稱為多泛素化。其中最為研究的多泛素化形式是通過泛素的第48位賴氨酸（K48鏈）形成鏈。單一泛素化已被證明可以改變靶蛋白的定位、活性和/或功能。多泛素化常見的后果是通過蛋白酶體介導(dǎo)的靶蛋白降解。

將泛素連接到靶蛋白需要三種不同連接酶的協(xié)同作用，即E1（泛素活化酶）、E2（泛素結(jié)合酶）和E3（泛素連接酶），從而在泛素的C-末端和靶蛋白上的賴氨酸殘基的ε-氨基團之間形成異肽鍵。泛素E3連接酶充當骨架蛋白，為泛素結(jié)合酶（E2）和目標底物提供停靠位點。通常，E3連接酶介導(dǎo)將泛素從E2硫酯中間體轉(zhuǎn)移至底物蛋白的酰胺連接（Hershko and Ciechanover, 1998）。除了對底物的泛素化，E3連接酶還可以對自身進行“自我泛素化”。  

LifeSensors的PROTAC體外泛素化檢測試劑盒旨在通過監(jiān)測蛋白質(zhì)固有的泛素化能力，可以準確預(yù)測PROTAC的效率。  

艾美捷PROTAC體外泛素化檢測試劑盒檢測原理：

使用預(yù)涂有專有的TUBE試劑（檢測板）的微孔板條，用于捕獲PROTAC依賴反應(yīng)中形成的多泛素鏈。在檢測過程中，首先將PROTAC加入到檢測板中，然后加入E3連接酶和待檢測的目標蛋白，以形成三元復(fù)合物。接下來，將含有野生型泛素和ATP的E1-E2酶混合物加入到孔中，以啟動PROTAC介導(dǎo)的泛素化反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，E1-E2-E3機制生成的多泛素鏈被識別并捕獲在孔中。在反應(yīng)和隨后的洗滌步驟后，將分離的多泛素化產(chǎn)物與目標蛋白的抗體（不包含在內(nèi)）和與-HRP偶聯(lián)的二抗（包含在內(nèi)）一起孵育，以便通過化學(xué)發(fā)光進行檢測。因此，在這種“三明治”ELISA樣的檢測方法中，捕獲的多泛素化產(chǎn)物產(chǎn)生的信號是PROTAC活性的定量指標。

PROTAC體外泛素化檢測試劑盒組分：

注意：將所有材料儲存于-80℃，避免多次凍融循環(huán)。所有組分至少穩(wěn)定保存2個月。

1：體外泛素化檢測板：注意不要將檢測板迅速解凍至室溫。建議最初將檢測板放置在4°C下30分鐘，然后再轉(zhuǎn)移到室溫下。

2：10倍檢測緩沖液：規(guī)格：1.2 mL，注意：在1倍檢測緩沖液中新鮮添加β-巰基乙醇，最終濃度為1mM。

3：E3混合液（2倍濃度）：規(guī)格：1 x 250 ul（20倍濃度），注意：將選擇的目標蛋白以40-80 nM的濃度加入提供的E3混合液中，以促進PROTAC和E3連接酶的三元復(fù)合物形成。

4：E1-E2-泛素混合液（2倍濃度）：規(guī)格：1 x 250 ul（20倍濃度）

5：二抗（抗小鼠或抗兔HRP偶聯(lián)）：規(guī)格：60uL（100倍濃度）

6：檢測試劑1和2：規(guī)格：1 mL的檢測試劑1和1 mL的檢測試劑2

7：阻斷濃縮液（5倍濃度）：規(guī)格：5 mL

8：陽性對照試劑

DMSO中的PROTAC（50倍濃度）：10 uL（MZP54，dBET6，A1874）

目標蛋白陽性對照BRD3（20倍濃度）：20 uL

抗-BRD3抗體（100倍濃度）：5 uL

抗小鼠HRP偶聯(lián)物（100倍濃度）：5 uL   

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