【介紹】

與傳統(tǒng)的二維（2D）培養(yǎng)相比，三維（3D）組織培養(yǎng)具有眾多優(yōu)勢(shì)^{[1; 5]}。最大限度地減少對(duì)硬表面的接觸可以改善細(xì)胞的成熟和存活，并提供一個(gè)更類似于細(xì)胞在體內(nèi)所接觸的環(huán)境。結(jié)合將特定的小分子引入3D水凝膠配方，并整合細(xì)胞附著位點(diǎn)如RGD肽，最近已經(jīng)能夠在體外更全面地重現(xiàn)越來越多的器官生態(tài)位，這有利于藥物發(fā)現(xiàn)和功能性組織工程^[2]。雖然來自小鼠細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的水凝膠選項(xiàng)如Matrigel?和Geltrex?已經(jīng)成為3D組織領(lǐng)域的主力一段時(shí)間了，但重要的是要注意，它們是從癌細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出來的，不是化學(xué)定義的，也不是無動(dòng)物源的；這對(duì)于再生醫(yī)學(xué)和人類3D組織建模的轉(zhuǎn)化工作都是主要挑戰(zhàn)^[3]。

在淺水凝膠涂層板表面上接種細(xì)胞是全3D培養(yǎng)和傳統(tǒng)2D培養(yǎng)之間的一種有吸引力的折衷方案，因?yàn)樗试S細(xì)胞避免接觸硬表面，并可以促進(jìn)細(xì)胞存活和成熟，同時(shí)仍然能夠保持高度的可重復(fù)性和可擴(kuò)展性。這些優(yōu)勢(shì)對(duì)神經(jīng)培養(yǎng)特別有益，因?yàn)檫@些細(xì)胞平均來說更脆弱，需要一個(gè)通常更復(fù)雜的組織生態(tài)位，并且對(duì)調(diào)節(jié)要求更嚴(yán)格，以重現(xiàn)適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)功能和成熟^[4]。在這里，我們比較了在常見的成熟測(cè)定中，在厚水凝膠涂層（淺3D組織培養(yǎng)）上生長(zhǎng)的廣泛使用的永生化神經(jīng)元細(xì)胞類型的形態(tài)、自我組織和存活情況。

【材料和方法】

神經(jīng)細(xì)胞在未分化狀態(tài)下的維持

B35大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤永生化細(xì)胞（ATCC CRL - 2754）用于在體外模擬神經(jīng)元的長(zhǎng)期成熟和存活。細(xì)胞在補(bǔ)充有10％FBS和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中保持活躍分裂和未分化狀態(tài)，如有必要，每周進(jìn)行兩次完全培養(yǎng)基更換。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到約80％匯合時(shí)，使用胰蛋白酶 - EDTA在室溫下孵育5分鐘，以1:10的比例傳代。平均而言，以這種方式維持的培養(yǎng)物可以每4天傳代一次，并可以擴(kuò)增超過20代，而不會(huì)失去分裂潛力，或在血清撤出后其成熟狀態(tài)不會(huì)退化。

神經(jīng)元在VitroGel和Matrigel上的分化和生長(zhǎng)，用于2D厚凝膠涂層（淺3D培養(yǎng)）

B35神經(jīng)元通過根據(jù)ATCC指南撤出血清在2D厚水凝膠涂層（淺3D封裝）培養(yǎng)中進(jìn)行分化。簡(jiǎn)而言之，為了達(dá)到功能性神經(jīng)狀態(tài)，B35細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中維持，在約5天內(nèi)它們變得后有絲分裂和突觸活性。

對(duì)于2D厚水凝膠涂層（淺3D培養(yǎng)），未分化的B35細(xì)胞添加在VitroGel 3D（TWG001；TheWell Bioscience。水凝膠與DMEM的比例為4:1）或Matrigel（80％Matrigel，20％在DMEM中）的頂部。兩種水凝膠均在37°C下凝膠20分鐘，然后用B35分化培養(yǎng)基（DMEM +青霉素/鏈霉素）灌注長(zhǎng)達(dá)21天。

淺3D組織培養(yǎng)在體外21天孵育期間的表征

在將細(xì)胞接種到水凝膠上后立即撤出培養(yǎng)中的FBS以誘導(dǎo)分化。隨后，細(xì)胞每周喂食兩次，每次進(jìn)行完全無血清培養(yǎng)基更換，持續(xù)三周。

神經(jīng)培養(yǎng)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析

為了表征培養(yǎng)狀態(tài)、形態(tài)和存活情況，細(xì)胞在第3天、第7天、第9天和第21天固定，并對(duì)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物Beta - III - Tubulin（T5076；Sigma - Aldrich）進(jìn)行染色，以觀察細(xì)胞對(duì)表面的附著、形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞用驢抗小鼠AlexaFluor647（ThermoFisher）和DAPI（ThermoFisher）核染色劑進(jìn)行復(fù)染。

【結(jié)果】

長(zhǎng)期分化的神經(jīng)培養(yǎng)物在3D培養(yǎng)中優(yōu)先存活和自我組織

在21天的時(shí)間過程中，對(duì)分化的B35神經(jīng)元培養(yǎng)物（約10K細(xì)胞/構(gòu)建體）進(jìn)行評(píng)估，以觀察其細(xì)胞形態(tài)是否與典型的神經(jīng)元突起、細(xì)胞存活和在厚水凝膠床內(nèi)的自我組織一致，無論是VitroGel 3D還是Matrigel，它們都接種在其上。我們使用神經(jīng)元特異性標(biāo)記物Beta - III - Tubulin來評(píng)估培養(yǎng)物內(nèi)的關(guān)鍵形態(tài)變化。

早在分化后第3天，細(xì)胞就擴(kuò)散并形成神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)細(xì)胞存活、培養(yǎng)擴(kuò)散和形態(tài)分析，在第7天和第9天之間，VitroGel 3D和Matrigel之間的效果相當(dāng)。在Matrigel墊上，一旦第9天過去，細(xì)胞培養(yǎng)健康和活力就會(huì)急劇下降，到第14天大多數(shù)細(xì)胞分離，神經(jīng)突回縮，到第21天絕大多數(shù)細(xì)胞消失。如果生長(zhǎng)在VitroGel 3D墊上，分化的B35神經(jīng)元很早就有傾向于自我組織成3D簇（第7天），在時(shí)間過程的前兩周假設(shè)為混合的2D/3D細(xì)胞培養(yǎng)。到第21天，這些細(xì)胞已經(jīng)遷移到自組裝的3D簇中，嵌入到厚水凝膠基質(zhì)中，簇之間的細(xì)胞很少，但沒有任何顯著的細(xì)胞死亡（圖1）。

圖1：接種在厚水凝膠墊上的長(zhǎng)期神經(jīng)元培養(yǎng)的比較。細(xì)胞用Beta - III - Tubulin（綠色）細(xì)胞骨架標(biāo)記物染色，其細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）復(fù)染。

長(zhǎng)期分化的神經(jīng)培養(yǎng)物在涂有VitroGel 3D - RGD的平板上的2D培養(yǎng)中存活并形成廣泛的神經(jīng)突起

除了2D厚凝膠涂層方法外，B35神經(jīng)元也可以在2D薄凝膠涂層方法上進(jìn)行分化和維持。對(duì)于2D薄凝膠涂層培養(yǎng)，組織培養(yǎng)處理的平板用VitroGel 3D - RGD（TWG002；TheWell Bioscience。1:20稀釋）與DMEM在室溫下混合兩小時(shí)，或用Matrigel（從庫存中在DMEM中1:100稀釋；約80 - 120?g/ml）也在室溫下混合兩小時(shí)進(jìn)行涂層。在兩周的過程中跟蹤細(xì)胞對(duì)表面的粘附表明，接種在VitroGel 3D - RGD上的細(xì)胞能夠很好地粘附并在撤出胎牛血清（FBS）后以典型的神經(jīng)形態(tài)擴(kuò)散，這會(huì)觸發(fā)B35細(xì)胞系分化為后有絲分裂神經(jīng)元。在同一時(shí)間段內(nèi)，也在Matrigel上進(jìn)行了對(duì)照接種（圖2）。總體而言，VitroGel 3D - RGD允許細(xì)胞粘附與Matrigel相當(dāng)，培養(yǎng)物能夠以類似的方式進(jìn)行分化，并且在兩種情況下都觀察到了神經(jīng)突延伸。VitroGel可以提供無動(dòng)物源和化學(xué)定義的表面涂層，這將允許對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行更強(qiáng)的控制，并減少復(fù)雜實(shí)驗(yàn)中的混雜因素。

 圖2：接種在薄2D水凝膠涂層上的長(zhǎng)期神經(jīng)元培養(yǎng)的比較。大鼠永生化B35細(xì)胞接種在VitroGel 3D - RGD或Matrigel上，通過血清撤出進(jìn)行分化，并維持兩周以跟蹤神經(jīng)突延伸和細(xì)胞附著。

【討論】

根據(jù)我們的結(jié)果，我們推測(cè)VitroGel 3D和Matrigel都能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)支持細(xì)胞分化，目前使用B35細(xì)胞的大多數(shù)神經(jīng)測(cè)定都是在這段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的。由于Matrigel的基質(zhì)中由于其來源而含有生長(zhǎng)因子和增殖/保護(hù)可溶性分子，因此在這種特定培養(yǎng)中可能具有輕微的優(yōu)勢(shì)，但在長(zhǎng)期維持后期，這種趨勢(shì)似乎會(huì)逆轉(zhuǎn)，分化的B35神經(jīng)元在體外第14天后從水凝膠墊上分離并漂浮。在我們的研究中，VitroGel在支持神經(jīng)元長(zhǎng)期成熟和存活方面表現(xiàn)出與Matrigel對(duì)照相當(dāng)或更好的性能。這并不意外，因?yàn)镸atrigel和實(shí)際上一般的3D培養(yǎng)已經(jīng)被報(bào)道在傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)中提供細(xì)胞保護(hù)、增殖和成熟優(yōu)勢(shì)^[5]。

在我們的研究中，VitroGel 3D是一種完全化學(xué)定義和無動(dòng)物源的水凝膠，細(xì)胞活力沒有顯著損失。這與Matrigel相比具有優(yōu)勢(shì)，Matrigel不是無動(dòng)物源的，也不是化學(xué)定義的，因此如果用作厚涂層支持或與人類來源的神經(jīng)元、心肌細(xì)胞等敏感細(xì)胞的全3D組織基質(zhì)使用，可能會(huì)產(chǎn)生意想不到的副作用。由于其配方的性質(zhì)，VitroGel沒有固有的預(yù)先存在的生長(zhǎng)因子。該系統(tǒng)可以通過接種可溶性因子進(jìn)一步修改以重現(xiàn)所需的生態(tài)位，并且可以以受控、可重復(fù)和定義的方式進(jìn)行，這使其非常適合用于人類疾病的無動(dòng)物源模型和器官模擬開發(fā)的支架。

【參考文獻(xiàn)】

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