【介紹】 

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成人多能干細(xì)胞，可分化為骨、軟骨、脂肪和結(jié)締組織。在過(guò)去的二十年中，由于其廣泛的可塑性、免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性，以及相對(duì)容易從脂肪組織、骨髓、臍帶血和滑液中以患者特異性的方式分離出來(lái)，它們已成為再生醫(yī)學(xué)中胚胎干細(xì)胞的一種廣受歡迎的潛在替代品。在體外，它們已被反復(fù)證明能夠生成各種非中胚層和非間充質(zhì)組織，包括肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和黑素細(xì)胞。它們的免疫調(diào)節(jié)能力使它們受歡迎，不僅因?yàn)樗鼈優(yōu)橹委熞郧半y以治療的疾病（如移植物抗宿主病和器官移植）帶來(lái)了希望，而且因?yàn)榕c誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和胚胎干細(xì)胞（ESC）衍生的組織相比，任何來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞的組織本身幾乎不會(huì)引起免疫反應(yīng)。 然而，盡管它們具有治療潛力，但有一個(gè)主要的挫折：在體外，它們的增殖速率往往會(huì)急劇減慢，并且容易衰老，這使得它們難以擴(kuò)增到足夠的治療用量。一些研究表明，調(diào)整培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度可以減輕一些衰老，但這意味著在與臨床無(wú)關(guān)的環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，這最終可能會(huì)改變它們的遺傳穩(wěn)定性。已經(jīng)對(duì)2D細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)表達(dá)模式的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)2D培養(yǎng)往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架和細(xì)胞核的整體扁平化，進(jìn)而導(dǎo)致基因和基因表達(dá)的改變以及細(xì)胞外基質(zhì)的重排。三維培養(yǎng)已被證明在維持細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境方面更為成功，并能產(chǎn)生更均勻、可重復(fù)的結(jié)果，在包括移植在內(nèi)的臨床應(yīng)用中也取得了更多的成功。 OP9細(xì)胞是一種特征明確的小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系，由于編碼巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M - CSF）的基因發(fā)生骨硬化突變，該細(xì)胞系不產(chǎn)生功能性M - CSF。OP9細(xì)胞最初用于與小鼠胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)，以誘導(dǎo)其分化為血細(xì)胞，但它們已被表征為間充質(zhì)干細(xì)胞。在這里，我們討論了在VitroGel 水凝膠系統(tǒng)上培養(yǎng)OP9的3D細(xì)胞培養(yǎng)，包括VitroGel 3D - RGD和新的VitroGel RGD - PLUS，它們含有不同水平的整合素結(jié)合配體修飾（RGD肽），用于不同的細(xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用。（VitroGel 3D - RGD是一種即用型可調(diào)水凝膠系統(tǒng)，用RGD細(xì)胞粘附肽修飾，促進(jìn)3D細(xì)胞培養(yǎng)期間的細(xì)胞附著和細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用。VitroGel RGD - PLUS與常規(guī)VitroGel 3D - RGD相比，用3倍更高濃度的RGD肽修飾，即使在水凝膠稀釋后也能保持高水平的整合素結(jié)合活性，支持需要強(qiáng)細(xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用的細(xì)胞。） 材料和方法 細(xì)胞培養(yǎng) OP9細(xì)胞在添加了10％FBS和1x pen - strep的α - z低必需培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到80 - 90％匯合時(shí)進(jìn)行傳代。對(duì)于2D水凝膠涂層培養(yǎng)和3D細(xì)胞培養(yǎng)，根據(jù)用戶(hù)手冊(cè)，使用VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS，如下所述。 2D涂層培養(yǎng)方法 用VitroGel稀釋溶液（類(lèi)型1）以1:0、1:1和1:3的稀釋度制備2D涂層水凝膠，然后與無(wú)細(xì)胞的OP9培養(yǎng)基以4:1的比例混合；向每個(gè)24孔板中加入300μl。水凝膠在室溫下穩(wěn)定20分鐘，然后將細(xì)胞添加到懸浮在300μl覆蓋培養(yǎng)基中的水凝膠頂部。每隔一天更換培養(yǎng)基。 3D涂層培養(yǎng)方法 根據(jù)制造商的方案，用VitroGel稀釋溶液（類(lèi)型1）以1:3的稀釋度制備水凝膠。對(duì)于共聚焦/熒光成像，使用底部有蓋玻片的8孔室培養(yǎng)細(xì)胞，每孔使用200μl水凝膠。每隔一天更換培養(yǎng)基。 免疫熒光（IF）成像 由于細(xì)胞具有GFP報(bào)告基因，我們進(jìn)行了活細(xì)胞成像。使用具有z堆棧功能的Leica TCS SP8掃描共聚焦顯微鏡在10X和20X放大倍數(shù)下拍攝圖像，并通過(guò)LAS X軟件和ImageJ進(jìn)行處理。使用LAS X軟件和ImageJ進(jìn)行圖像的處理和分析。

【結(jié)果】

在2D VitroGel培養(yǎng)中，OP9細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞聚集和健康的細(xì)胞形態(tài)。 我們?cè)谠嫉腣itroGel 3D - RGD和新的VitroGel RGD - PLUS中評(píng)估了2D培養(yǎng)中的OP9細(xì)胞。在組織培養(yǎng)板表面的標(biāo)準(zhǔn)2D培養(yǎng)中，OP9細(xì)胞與許多間充質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型一樣，采用成纖維細(xì)胞樣形狀，并且無(wú)法聚集（圖1A）。在這種環(huán)境中，間充質(zhì)干細(xì)胞增殖不佳，可能導(dǎo)致衰老。此外，它們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出與凋亡階段通常相關(guān)的特征性亮點(diǎn)。為了了解在我們的可調(diào)系統(tǒng)中OP9培養(yǎng)的z佳條件，我們?cè)赩itroGel的各種稀釋液中培養(yǎng)這些細(xì)胞。在VitroGel 3D - RGD中（圖1B - D），僅在細(xì)胞培養(yǎng)2天后，細(xì)胞在所有稀釋度下都形成聚集。對(duì)于更新的VitroGel RGD - PLUS（圖1E - G），細(xì)胞更加健壯，在z低稀釋度下形成大的集落并表現(xiàn)出健康的MSC形態(tài)。

圖1：OP9 - GFP細(xì)胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS的2D水凝膠涂層表面上生長(zhǎng)。與標(biāo)準(zhǔn)2D培養(yǎng)（A）相比，OP9細(xì)胞在僅培養(yǎng)2天后在3D VitroGel環(huán)境中（B - G）附著和聚集得更好。在兩種VitroGel產(chǎn)品中，細(xì)胞在1:0稀釋度下顯示聚集（B，E），但在較低的凝膠強(qiáng)度物質(zhì)下，細(xì)胞在VitroGel RGD - PLUS上擴(kuò)散和附著得更好。

圖2：OP9 - GFP細(xì)胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS中的三維培養(yǎng)。雖然VitroGel 3D - RGD促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增（E，G），但新的VitroGel RGD - PLUS對(duì)OP9細(xì)胞增殖和細(xì)胞 - 細(xì)胞通信有更好的支持。

更強(qiáng)的細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用幫助細(xì)胞形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（F，H）。（圖像A，B，C，D，G，H在20X；圖像E＆F在10X）。 E的3D視圖 G的3D視圖 F的3D視圖 H的3D視圖 在VitroGel RGD - PLUS中培養(yǎng)OP9細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 這種特征在二維培養(yǎng)中通常是不可能的，并且在三維培養(yǎng)中可能會(huì)有所不同。為了了解我們的水凝膠系統(tǒng)是否能夠促進(jìn)這一點(diǎn)，我們?cè)谌S培養(yǎng)中用我們的兩種水凝膠培養(yǎng)OP9細(xì)胞。根據(jù)我們之前的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于3D細(xì)胞培養(yǎng)，OP9細(xì)胞更喜歡在軟的水凝膠基質(zhì)（G’ < 300 Pa）中生長(zhǎng)。因此，本研究選擇了1:3稀釋的稀釋VitroGel水凝膠。體內(nèi)3D微環(huán)境的一個(gè)主要因素是細(xì)胞形成細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)的能力。在VitroGel 3D - RGD中，培養(yǎng)7天后，細(xì)胞已沉淀到3D水凝膠中（圖2C，E，G）。細(xì)胞是活的，但根據(jù)第2天和第7天的圖像比較，增殖速率較低（圖2A＆C）。圖2E和G的3D視圖顯示，在常規(guī)VitroGel 3D - RGD中培養(yǎng)7天后，OP9細(xì)胞缺乏細(xì)胞間連接。另一方面，在VitroGel RGD - PLUS中培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出更多的3D成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，并形成了廣泛的細(xì)胞間連接（圖2D，F(xiàn)，H；圖2F和H的3D視圖）。

【討論】

 我們的研究表明，我們的新VitroGel RGD - PLUS可以成為依賴(lài)細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞應(yīng)用的理想三維支架。細(xì)胞分化和身份由復(fù)雜的細(xì)胞 - 細(xì)胞通信調(diào)節(jié)，這只能通過(guò)可擴(kuò)散配體在短距離內(nèi)實(shí)現(xiàn)；這種行為在體外難以模擬。它可能導(dǎo)致體外和體內(nèi)研究之間的變異性，從而阻礙轉(zhuǎn)化研究。 對(duì)于組織再生，特別是間充質(zhì)分化，與周?chē)?xì)胞通信的能力是絕對(duì)必要的。細(xì)胞通信通常通過(guò)細(xì)胞間的可擴(kuò)散因子在相對(duì)短的距離內(nèi)發(fā)生，這得益于三維環(huán)境提供的緊密接觸。然而，更長(zhǎng)距離的信號(hào)需要細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)。多項(xiàng)研究表明，不同種類(lèi)的支架和不同的彈性可以驅(qū)動(dòng)分化沿著不同的途徑進(jìn)行。VitroGel系統(tǒng)提供了一個(gè)足夠可調(diào)的平臺(tái)，以適應(yīng)任何應(yīng)用，減少變異性并簡(jiǎn)化過(guò)程。

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