【介紹】

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種發(fā)生在大腦或脊髓的侵襲性癌癥。多年來(lái)，為了幫助理解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展，人們開(kāi)發(fā)了各種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型。然而，由于促進(jìn)這種疾病的遺傳和環(huán)境因素多種多樣且復(fù)雜，以及其起源組織的不確定性，這一過(guò)程變得復(fù)雜。 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療也很難開(kāi)發(fā)，因?yàn)槎S培養(yǎng)系統(tǒng)無(wú)法模擬腫瘤微環(huán)境。腫瘤的進(jìn)展關(guān)鍵取決于腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互作用。腫瘤微環(huán)境是異質(zhì)和動(dòng)態(tài)的；它由細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、祖細(xì)胞、血管和淋巴管組成，這在二維環(huán)境中是不可能重現(xiàn)的。各種研究表明，在二維環(huán)境中培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞增殖能力、抗凋亡能力、分化能力、侵襲能力甚至生物標(biāo)志物表達(dá)方面表現(xiàn)出明顯的差異。此外，僅僅研究腫瘤來(lái)源的細(xì)胞是不夠的；腫瘤本質(zhì)上是三維的，這種形態(tài)在腫瘤進(jìn)展中起著作用，即血管生成，這是惡性腫瘤的關(guān)鍵因素。此外，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了具有類似干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞，它們被認(rèn)為是導(dǎo)致對(duì)常規(guī)治療的高抗性和高復(fù)發(fā)率的原因。因此，準(zhǔn)確有效地開(kāi)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方法將需要三維模型，這些模型能夠緊密模擬三維腫瘤中表現(xiàn)出的細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用。 U - 87 MG細(xì)胞是一種人類原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，常用于研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的因果關(guān)系和進(jìn)展。在這里，我們討論使用我們的二維和三維VitroGel可調(diào)支架培養(yǎng)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。 材料和【方法】 

細(xì)胞培養(yǎng) 

U - 87 MG細(xì)胞在添加了10％FBS和1x pen - strep的Eagle最低必需培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到80 - 90％匯合時(shí)進(jìn)行傳代。對(duì)于2D水凝膠涂層培養(yǎng)和3D細(xì)胞培養(yǎng)，根據(jù)用戶手冊(cè)，使用VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS，如下所述。

2D涂層培養(yǎng)方法 

用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:0、1:1和1:3的稀釋度制備2D涂層水凝膠，然后與無(wú)細(xì)胞的U - 87 MG培養(yǎng)基以4:1的比例混合；向每個(gè)24孔板中加入300μL。水凝膠在室溫下穩(wěn)定20分鐘，然后將細(xì)胞添加到懸浮在300μL覆蓋培養(yǎng)基中的水凝膠頂部。每隔一天更換培養(yǎng)基。     

3D涂層培養(yǎng)方法 

根據(jù)制造商的方案，用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:1和1:3的稀釋度制備水凝膠。對(duì)于共聚焦/熒光成像，使用底部有蓋玻片的8孔室培養(yǎng)細(xì)胞，每孔使用200μL水凝膠。每隔一天更換培養(yǎng)基。 免疫

熒光（IF）成像 

對(duì)于IF成像，細(xì)胞在有蓋玻片的腔室載玻片上生長(zhǎng)，而不是在8孔板上。每個(gè)腔室容納200μL水凝膠/細(xì)胞混合物。根據(jù)制造商的方案，使用Image - iT?固定/透化試劑盒、ActinGreen?488 ReadyProbes?試劑和NucBlue?固定細(xì)胞ReadyProbes?試劑（ThermoFisher）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。使用帶有ZEN軟件和ImageJ的Zeiss Axiovert 200M熒光細(xì)胞成像顯微鏡拍攝圖像。

【結(jié)果】 

在2D VitroGel系統(tǒng)上培養(yǎng)U - 87 MG細(xì)胞促進(jìn)球體形態(tài)的形成。 為了研究我們的2D VitroGel系統(tǒng)是否有利于U - 87 MG細(xì)胞在二維系統(tǒng)中的生長(zhǎng)，我們?cè)谖覀兊膬煞NVitroGel產(chǎn)品的各種稀釋液中培養(yǎng)它們。U - 87 MG細(xì)胞從人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤中收獲，盡管在標(biāo)準(zhǔn)的2D培養(yǎng)中它們的固有性質(zhì)是聚集，但它們采用成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，僅形成小聚集體（圖1A）。在VitroGel水凝膠中，細(xì)胞表現(xiàn)出更多的球體聚集，即使在較低的稀釋度下（圖1B - E）。在兩種水凝膠的1:3稀釋度下（圖1C，E），形成的集落較小，但在新的更軟的VitroGel RGD - PLUS中，細(xì)胞聚集體表現(xiàn)出一種有趣的形態(tài)特征：它們?cè)诰奂w之間形成橋梁（圖1E）。

 圖1：U - 87 MG細(xì)胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS的2D水凝膠厚涂層表面上生長(zhǎng)2天。在1:0稀釋度下，細(xì)胞在兩種水凝膠的表面聚集形成球體（B，C）。在1:3稀釋度下（C，E），柔軟的物質(zhì)有助于細(xì)胞在VitroGel RGD - PLUS表面的不同球體之間建立連接（黃色箭頭）。 VitroGel RGD - PLUS在3D培養(yǎng)7天后促進(jìn)細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展 為了進(jìn)一步研究VitroGel RGD - PLUS促進(jìn)細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)形成的能力，我們?cè)诓煌♂尪鹊娜S培養(yǎng)中培養(yǎng)U - 87 MG細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，在原始VitroGel 3D - RGD的兩種濃度下，細(xì)胞都可以在水凝膠中沉淀和生長(zhǎng)（第2天，圖2A - B），但在7天后（圖2D - E），它們的總體擴(kuò)散沒(méi)有改變，它們可以形成簇狀結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)連接（圖2E）。在VitroGel RGD - PLUS中，細(xì)胞不僅在第2天就沉淀到水凝膠中，而且它們表現(xiàn)出與VitroGel 3D - RGD中細(xì)胞明顯不同的形態(tài)：它們更長(zhǎng)，并開(kāi)始建立細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)。7天后，它們?cè)?D水凝膠中表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞 - 細(xì)胞連接（圖2H - I），其簇比VitroGel 3D - RGD中的簇大得多（圖2J）。

圖2：U - 87 MG細(xì)胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS中培養(yǎng)。細(xì)胞可以在兩種水凝膠的1:1和1:3稀釋度的3D水凝膠中生長(zhǎng)。細(xì)胞在VitroGel 3D - RGD中融入水凝膠（A - D），但無(wú)法形成網(wǎng)絡(luò)連接（E）。然而，在新的VitroGel RGD - PLUS中，細(xì)胞在2天后融入（F - G），但在第7天能夠形成細(xì)胞間肌動(dòng)蛋白連接（H - J）。

【討論】 

與VitroGel 3D - RGD中的球體結(jié)構(gòu)不同，U - 87 MG細(xì)胞在VitroGel RGD - PLUS中創(chuàng)建更好的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明更好的細(xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用。這些相互作用是正確重現(xiàn)體內(nèi)組織組織和再生以及體外癌癥的關(guān)鍵部分。盡管這一點(diǎn)得到了認(rèn)可，但研究人員發(fā)現(xiàn)很難解決這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)檫@個(gè)問(wèn)題不僅僅有一種解決方案。例如，在標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)細(xì)胞生態(tài)位中，存在各種類型的細(xì)胞相互作用、形狀、連接等。對(duì)現(xiàn)有三維支架的研究表明，驅(qū)動(dòng)組織表面張力從而影響細(xì)胞命運(yùn)的細(xì)胞間凝聚力在組織的不同部分之間可能會(huì)有很大差異。考慮到一些三維基質(zhì)更適合某些細(xì)胞類型而不適合其他細(xì)胞類型，這會(huì)給試圖使用三維細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究帶來(lái)一定程度的變異性，這可能會(huì)成為問(wèn)題。即使在我們自己的研究中，這一點(diǎn)也很明顯。我們看到，相同基質(zhì)的不同濃度可能導(dǎo)致不同的細(xì)胞行為，即使細(xì)胞能夠在所有濃度下生長(zhǎng)。 產(chǎn)生適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)相互作用的能力也將是正確理解腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵部分。大量的癌癥進(jìn)展是由于腫瘤細(xì)胞與周圍環(huán)境相互作用的能力。例如，在腫瘤生長(zhǎng)期間，轉(zhuǎn)移過(guò)程始于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的剝奪，這會(huì)觸發(fā)血管生成生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的釋放，從而導(dǎo)致血管生成。這種營(yíng)養(yǎng)和氧氣剝奪只有在達(dá)到一定的生長(zhǎng)閾值后才會(huì)發(fā)生，而這在二維培養(yǎng)中是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，并且需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 基質(zhì)相互作用才能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)建模。 我們的研究和其他研究表明，一個(gè)更可調(diào)的系統(tǒng)最終可能最有希望在體外真正模擬體內(nèi)系統(tǒng)。器官再生的未來(lái)將需要開(kāi)發(fā)能夠捕捉體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)特性復(fù)雜性的平臺(tái)，同時(shí)也能夠調(diào)整基質(zhì)特性，為組織內(nèi)的各種細(xì)胞提供體內(nèi)環(huán)境。未來(lái)的癌癥研究將依賴于一個(gè)三維可調(diào)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將真實(shí)地代表實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，并將真實(shí)地重現(xiàn)腫瘤對(duì)假定治療的反應(yīng)。以前對(duì)VitroGel可調(diào)水凝膠的研究表明，它們是藥物測(cè)試的可行選擇，各種研究已經(jīng)證明了這種水凝膠在癌癥研究中的成功。新的VitroGel RGD - PLUS中細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)能力的增強(qiáng)表明，這種新的基質(zhì)可能為癌癥和再生醫(yī)學(xué)研究提供可行的解決方案。

【參考文獻(xiàn)】

Kutwin, M. et al. Investigation of platinum nanoparticle properties against U87 glioblastoma multiforme. Arch Med Sci 13, 1322–1334 (2017).

Liu, H. et al. Differentiation of human glioblastoma U87 cells into cholinergic neuron. Neurosci. Lett. 704, 1–7 (2019).

Miyai, M. et al. Current trends in mouse models of glioblastoma. J. Neurooncol. 135, 423–432 (2017).

Wu, M. & Swartz, M. A. Modeling tumor microenvironments in vitro. J Biomech Eng 136, 021011 (2014).

Stock, K. et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Sci Rep 6, 28951 (2016).

Riedl, A. et al. Comparison of cancer cells in 2D vs 3D culture reveals differences in AKT-mTOR-S6K signaling and drug responses. J. Cell. Sci. 130, 203–218 (2017).

Amann, A. et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Sci Rep 7, 2963 (2017).

Murat, A. et al. Stem cell-related ‘self-renewal’ signature and high epidermal growth factor receptor expression associated with resistance to concomitant chemoradiotherapy in glioblastoma. J. Clin. Oncol. 26, 3015–3024 (2008).

Oh, S.-J. et al. Human U87 glioblastoma cells with stemness features display enhanced sensitivity to natural killer cell cytotoxicity through altered expression of NKG2D ligand. Cancer Cell Int. 17, 22 (2017).

Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J. & Karsdal, M. A. The importance of extracellular matrix for cell function and in vivo likeness. Exp. Mol. Pathol. 98, 286–294 (2015).

Manning, M. L., Foty, R. A., Steinberg, M. S. & Schoetz, E.-M. Coaction of intercellular adhesion and cortical tension specifies tissue surface tension. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 12517–12522 (2010).

Melissaridou, S. et al. The effect of 2D and 3D cell cultures on treatment response, EMT profile and stem cell features in head and neck cancer. Cancer Cell Int. 19, 16 (2019).

Voss, M. J., Niggemann, B., Z?nker, K. S. & Entschladen, F. Tumour reactions to hypoxia. Curr. Mol. Med. 10, 381–386 (2010).

Mimeault, M. & Batra, S. K. Hypoxia-inducing factors as master regulators of stemness properties and altered metabolism of cancer- and metastasis-initiating cells. J. Cell. Mol. Med. 17, 30–54 (2013).

Foty, R. A. & Steinberg, M. S. Differential adhesion in model systems. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 2, 631–645 (2013).

Mahauad-Fernandez, W. D. & Okeoma, C. M. B49, a BST-2-based peptide, inhibits adhesion and growth of breast cancer cells. Sci Rep 8, 4305 (2018).

Li, X., Seebacher, N. A., Xiao, T., Hornicek, F. J. & Duan, Z. Targeting regulation of cyclin dependent kinase 9 as a novel therapeutic strategy in synovial sarcoma. J. Orthop. Res. 37, 510–521 (2019).

Akamandisa, M. P., Nie, K., Nahta, R., Hambardzumyan, D. & Castellino, R. C. Inhibition of mutant PPM1D enhances DNA damage response and growth suppressive effects of ionizing radiation in diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-oncology (2019). doi:10.1093/neuonc/noz053

Mahauad-Fernandez, W. D. et al. BST-2 promotes survival in circulation and pulmonary metastatic seeding of breast cancer cells. Sci Rep 8, 17608 (2018).