研究背景：

 

       慢性疾病如感染和惡性腫瘤患者常面臨惡病質(zhì)，這是一種多因素綜合征，可加重潛在疾病并惡化預(yù)后。惡病質(zhì)表現(xiàn)為行為癥狀和代謝癥狀，其嚴(yán)重程度因疾病和個(gè)體而異，難以定義和診斷。惡病質(zhì)患者表現(xiàn)為厭食癥、快感缺乏癥和嗜睡，以及體重意外下降5%以上。這是由脂肪和瘦肉塊的迅速消耗引起的，這不僅影響患者的生活質(zhì)量，而且往往是發(fā)病率和死亡率的主要原因。傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)支持不能逆轉(zhuǎn)惡病質(zhì)。雖然已經(jīng)探索了幾種治療方案，如生食欲激素促生成素激動(dòng)劑，但預(yù)防或減輕惡病質(zhì)的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)仍不明確。

 

      惡病質(zhì)的出現(xiàn)伴隨著大量的促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN) -γ,白介素(IL) 6和IL-17 。根據(jù)疾病模型，這些細(xì)胞因子可由腫瘤細(xì)胞分泌，如癌癥、宿主免疫細(xì)胞和/或參與代謝調(diào)節(jié)的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞。癌癥相關(guān)惡病質(zhì)(CAC)小鼠模型極大地提高了我們對(duì)體重減輕機(jī)制的理解。然而，適當(dāng)?shù)臋C(jī)制模型研究惡病質(zhì)的背景下感染仍不發(fā)達(dá)。在本研究中，我們使用了慢性病毒感染的小鼠基準(zhǔn)模型來探討感染相關(guān)惡病質(zhì)(IAC)的分子和細(xì)胞需求。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種遺傳、飲食和藥理學(xué)干擾的綜合方法來揭示CAC和IAC的共同和獨(dú)特特性。這導(dǎo)致了脂肪組織形態(tài)學(xué)、分子和代謝變化的表征，并確定了IAC的主要免疫驅(qū)動(dòng)因素，為惡病質(zhì)的病理生理學(xué)提供了急需的分子研究。

 

      研究目的：

 

      惡病質(zhì)是各種癌癥、慢性炎癥和感染的主要發(fā)病和死亡原因。對(duì)惡病質(zhì)發(fā)生機(jī)制的了解仍然有限，尤其是對(duì)感染相關(guān)性惡病質(zhì)(IAC)。本文描述了一種慢性病毒感染小鼠可逆性惡病質(zhì)模型，并確定了CD8+ T細(xì)胞在IAC中的重要作用。與癌癥相關(guān)惡病質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞因子與IAC無關(guān)。相反，病毒特異性CD8+ T細(xì)胞引起脂肪組織的形態(tài)學(xué)和分子變化，導(dǎo)致脂質(zhì)儲(chǔ)存的枯竭。這些變化發(fā)生在CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)峰值之前的時(shí)間點(diǎn)，需要T細(xì)胞固有的I型干擾素信號(hào)和抗原特異性啟動(dòng)。我們的研究結(jié)果將全身抗病毒免疫反應(yīng)與脂肪組織重塑聯(lián)系起來，揭示了CD8+ T細(xì)胞在IAC中的作用被低估。

 

      材料方法

 

       1.實(shí)驗(yàn)材料：C57BL/6野生型和基因突變型小鼠模型，(2 ×106 FFU) LCMV strain clone 1病毒

 

       2.實(shí)驗(yàn)方法：小鼠熱量測(cè)定，灌喂實(shí)驗(yàn)，抗體和藥物治療，EchoMRI-100H (EchoMRI LCC)成像技術(shù)，病理實(shí)驗(yàn)（HE染色，IF)，血清檢測(cè)，ELISA實(shí)驗(yàn)(KET0004, Abbkine)，RT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)，RNA-seq等。

 

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

 

      感染LCMV克隆13可導(dǎo)致可逆性惡病質(zhì)。野生型C57BL/6J小鼠感染淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)慢性株克隆2 106個(gè)焦點(diǎn)形成單元(FFU)，感染后第一周體重下降15 20%(圖1a)。為了評(píng)估這是惡病質(zhì)的表現(xiàn)還是厭食癥的直接結(jié)果，我們給感染了LCMV的小鼠喂食未感染的野生型小鼠，在感染后的兩周內(nèi)喂食與感染LCMV的小鼠相同數(shù)量的食物(成對(duì)喂食)。感染后6 - 8天，未感染組體重下降不到初始體重的3%，而感染組體重下降超過10%(圖1a,b)，說明厭食喂養(yǎng)行為不能完全解釋LCMV感染小鼠體重下降的全部程度。

 

      為了描述感染誘導(dǎo)的病理生理學(xué)，我們使用代謝籠來監(jiān)測(cè)LCMV感染小鼠與年齡和性別匹配的未感染小鼠的比較。感染后第6天和第8天之間，與未感染的小鼠相比，小鼠表現(xiàn)出嗜睡的跡象，并顯示出食物和水的攝入量、活動(dòng)和能量消耗減少(圖1b d和補(bǔ)充圖1a)。

 

      由CO2排放與O2消耗比值計(jì)算的呼吸交換率(respiratory exchange ratio, RER)在感染后第6天至第8天之間顯著降低(圖1d和補(bǔ)充圖1a)，說明LCMV感染小鼠主要依賴脂肪代謝作為能量底物。這些病理生理變化先于病毒負(fù)荷和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的峰值，后者發(fā)生在第8-12天(見補(bǔ)充圖1b-d)。第8天之后，盡管病毒持續(xù)存在，小鼠的體重開始緩慢回升(圖1a-c和補(bǔ)充圖1a-d)。

 

圖1 感染LCMV克隆13導(dǎo)致瞬時(shí)惡病質(zhì)。

 

      通過比較身體組分，我們發(fā)現(xiàn)，與成對(duì)喂養(yǎng)、未感染的小鼠相比，感染后的第一周，脂肪和瘦肉塊(肌肉)均嚴(yán)重減少(圖1e,f)。然而，與肌肉相比，脂肪組織在感染后4天內(nèi)經(jīng)歷了更早、更嚴(yán)重的消耗(圖1f)。隨著時(shí)間的推移，這種消耗影響了不同的脂肪庫(kù)，包括腹股溝白色脂肪組織、性腺白色脂肪組織和肩胛間棕色脂肪組織(圖1e)。為了評(píng)估肌肉質(zhì)量的損失，我們檢查了股四頭肌、腓腸肌和比目魚肌，它們同時(shí)代表慢肌和快肌。感染小鼠的四頭肌和腓腸肌的肌肉質(zhì)量與成對(duì)喂養(yǎng)的小鼠相比有所下降(圖1e)。這與成肌細(xì)胞分化標(biāo)記物MyoD1的表達(dá)降低、編碼Atrogin1和Murf1的Fbxo32和Trim63的表達(dá)增加有關(guān)，與成對(duì)喂養(yǎng)的小鼠相比，受感染小鼠的這三種肌肉均參與蛋白酶體降解(見補(bǔ)充圖1e g)。

 

      為了評(píng)價(jià)病毒接種量與體重減輕之間的關(guān)系，我們測(cè)定了LCMV克隆13的感染劑量，范圍從2 106 FFU到2 102 FFU。低病毒接種組體重減輕明顯改善;低于2104 FFU的劑量顯示體重幾乎沒有下降(見補(bǔ)充圖1h)。這些較低的病毒接種被認(rèn)為與加速病毒清除有關(guān)。急性LCMV感染與低劑量LCMV克隆13感染的體重動(dòng)力學(xué)相似(見補(bǔ)充圖1i)，提示病毒持久性的決定因素可能與惡病質(zhì)的發(fā)生有關(guān)。

 

      為了檢驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充是否能改善體重減輕，我們?cè)诟腥竞蟮?天至第8天之間，使用口服灌胃給LCMV克隆13只受感染的小鼠每日1千卡的類似于高湯的控制飲食、葡萄糖、橄欖油或酪蛋白。與補(bǔ)充pbs的對(duì)照組相比，口服灌胃并沒有減輕體重(圖1i)。相反，與補(bǔ)充pbs的lcmv感染小鼠相比，所有補(bǔ)充灌胃組的恢復(fù)速度都較慢(見補(bǔ)充圖1j)，這表明病毒引起的體重下降無法通過營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充來預(yù)防。這些結(jié)果揭示了13只LCMV克隆感染小鼠惡病質(zhì)的幾個(gè)特征，包括厭食癥和代謝功能障礙，以及無法通過營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充逆轉(zhuǎn)的脂肪和肌肉量減少。

 

      病毒感染引起脂肪組織重塑和脂肪分解。與未感染的對(duì)照組相比，LCMV感染小鼠脂肪組織的皮下和內(nèi)臟室均發(fā)生衰竭（圖2a）。通過組織學(xué)分析，與未感染小鼠相比，感染LCMV的腹股溝脂肪組織的形態(tài)學(xué)變化，我們觀察到感染后第6天和第8天脂肪細(xì)胞的大小顯著減小（圖2b，c）。接下來，我們測(cè)定了LCMV感染后第0、4、6和8天腹股溝脂肪組織中脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和激素敏感脂肪酶（HSL）的蛋白質(zhì)豐度和激活狀態(tài)，這兩種酶是脂肪溶解的兩個(gè)中心酶。與未感染的小鼠相比，LCMV感染期間腹股溝脂肪組織中ATGL和HSL以及磷酸化HSL（PHSL）的表達(dá)在Ser660殘基處磷酸化，這表明感染后第6天脂肪分解峰值增加。這與未感染的對(duì)照組相比，LCMV感染小鼠血清中非酯化脂肪酸（NEFAs）水平升高（圖2E）證實(shí)了這一點(diǎn)。

 

      此外，脂蛋白脂酶（LPL）的減少信使RNA的表達(dá)，并在較小程度上降低了腹股溝脂肪中的脂肪清除受體CD36，以及與被喂食的未感染小鼠相比，LCMV感染小鼠血清中甘油三酯水平的升高（圖2E，F(xiàn)），IN。降低脂肪組織中的脂質(zhì)攝取率和/或肝臟中的脂質(zhì)動(dòng)員。Dgat2（甘油三酯生物合成中的限速酶）的mRNA表達(dá)下降（圖2f），也表明LCMV感染的MICE15脂質(zhì)合成率較低。值得注意的是，感染小鼠的腹股溝脂肪墊顯示血管化增加（參見補(bǔ)充圖2b，c），這可能與炎癥介導(dǎo)的組織重塑有關(guān)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，LCMV克隆13感染通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子導(dǎo)致脂肪組織中脂質(zhì)儲(chǔ)存的耗盡。

 

      為了研究病毒誘導(dǎo)的脂肪組織衰竭是否遵循與CAC相似的機(jī)制，我們檢測(cè)了UCP1的mRNA表達(dá)作為脂肪組織老化的指標(biāo)。感染小鼠的帽間、腹股溝和性腺脂肪中ucp1的mRNA表達(dá)比成對(duì)喂養(yǎng)小鼠略低（圖2g）。根據(jù)Lewis肺癌惡病質(zhì)模型和ATGL/和HSL/MICE16黑色素瘤模型，ATGL或HSL的缺失足以改善惡病質(zhì)小鼠的體重減輕，ATGL/的缺失更為深刻，說明ATGL和HSL在CAC中的重要作用。為了確定IAC是否需要這些脂肪酶，我們感染了atgl fl fl adipoqcre/+和hslfl/fl adipoqcre/+小鼠，這些小鼠在脂聯(lián)素（adipoqq）啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下有條件地切除脂肪細(xì)胞中的atgl和hsl。我們發(fā)現(xiàn)，與氟化物對(duì)照組相比，兩種脂肪酶的消融術(shù)均不能降低LCMV感染期間的體重減輕程度（圖2h），這表明IAC不需要脂肪酶。

 

      激素生長(zhǎng)激素釋放肽和脂肪因子（如瘦素和脂聯(lián)素）被認(rèn)為是代謝和免疫過程的活性調(diào)節(jié)劑。LCMV感染和未感染小鼠血清生長(zhǎng)激素釋放肽的數(shù)量和腹股溝脂肪組織脂聯(lián)素的表達(dá)相似（見補(bǔ)充圖2D，F(xiàn)）。值得注意的是，循環(huán)中的瘦素水平顯示LCMV感染減少，而第6天腹股溝脂肪組織中瘦素的mRNA表達(dá)增加（參見補(bǔ)充圖2e，f），這表明瘦素可能參與了IAC期間脂肪組織的消瘦。然而，瘦素缺乏的lepob/ob小鼠在LCMV感染后體重下降率與lepob/+小鼠相似，并表現(xiàn)出厭食（參見補(bǔ)充圖2g）。我們還量化了lepob/ob和lepob/+小鼠感染后8天內(nèi)的脂肪和瘦肉量的損失，發(fā)現(xiàn)兩組的脂肪和瘦肉室的消耗量相等（參見補(bǔ)充圖2h），這表明，盡管瘦肉素在脂肪組織中的表達(dá)量增加了，但它卻降低了小鼠的脂肪和瘦肉量。不介導(dǎo)LCMV感染過程中的活性脂肪溶解狀態(tài)或進(jìn)食行為的中斷。這些結(jié)果表明，IAC在感染后第6天到第8天之間觸發(fā)脂肪組織的結(jié)構(gòu)和代謝重編程。

 

圖2 |感染相關(guān)性惡病質(zhì)引發(fā)嚴(yán)重的脂肪組織重塑和脂肪分解增加。

 

      感染相關(guān)的惡病質(zhì)由I型干擾素和CD8+T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)。在各種惡病質(zhì)和脂肪組織重塑模型中，細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF和IL-6觸發(fā)體重減輕，獨(dú)立或與其他細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞一起發(fā)揮作用。對(duì)32種細(xì)胞因子進(jìn)行珠子的多重分析，以及IFN-α和IFN-β的ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血清細(xì)胞因子具有高度動(dòng)態(tài)的模式，并且在野生型LCMV克隆13感染后的第一個(gè)96小時(shí)內(nèi)，IFN-γ、TNF、IL-6、IFN-α和IFN-β的誘導(dǎo)。小鼠（圖3a和補(bǔ)充圖2a和補(bǔ)充表1）。參與CAC的細(xì)胞因子，如IL-1β和白血病抑制因子8，19，LCMV感染小鼠的血清沒有增加（參見補(bǔ)充圖3A和補(bǔ)充表1）。與促炎細(xì)胞因子相關(guān)的途徑，如IFN-γ、TNF和IL-6與Cac8,20有關(guān)。通過使用ifng/、tnf/和tnfri/小鼠進(jìn)行基因消融術(shù)中和ifn-γ、tnf和il-6，或在感染前1天開始抗體介導(dǎo)的阻斷，然后每2天繼續(xù)進(jìn)行，不能改善LCMV感染小鼠的體重減輕（圖3b，c）。

 

      感染的小鼠，我們同時(shí)使用中和抗體去除干擾素-γ和腫瘤壞死因子，在感染后第8天仍然損失高達(dá)20%的體重（圖3b）。在感染的前2天內(nèi)，LCMV感染小鼠血清中檢測(cè)到1型IFNs（圖3A）21。與野生型LCMV感染小鼠（圖3d和補(bǔ)充圖3b，c）相比，使用IFNAR1/小鼠對(duì)IFN-α/β-受體α鏈（IFNAR）信號(hào)的遺傳消融導(dǎo)致感染后8天體重減輕約10%，這表明I型IFN反應(yīng)與IAC有關(guān)。

 

圖31型IFN和CD8 T細(xì)胞在誘導(dǎo)感染相關(guān)性惡病質(zhì)中起重要作用。

 

      接下來，我們確定一個(gè)特定的T細(xì)胞群體是否在LCMV感染期間介導(dǎo)體重減輕。這是通過在LCMV感染（圖3e、f）或CD8/小鼠感染（圖3f）前2天和1天分別靜脈注射CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的消耗性抗體來完成的。在LCMV感染的小鼠中，CD4+T細(xì)胞的耗竭不能保護(hù)體重減輕（圖3e和補(bǔ)充圖3d f）；但是，與野生型對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞的耗竭幾乎沒有導(dǎo)致體重減輕（圖3f和補(bǔ)充圖3d-f）。這些結(jié)果提示CD8+T細(xì)胞在IAC中起著關(guān)鍵作用。

 

      創(chuàng)新點(diǎn)

 

      在這項(xiàng)研究中，為了闡明IAC是炎癥因子，研究人員運(yùn)用了一個(gè)慢性病毒感染模型。IAC在感染后6天出現(xiàn)，在第12天出現(xiàn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)高峰之前，隨后逐漸消退，與Cac3,5的終末病程相反。在本研究中報(bào)道了I型干擾素和CD8+T細(xì)胞在觸發(fā)IAC中的作用，但不包括IL-6、TNF和IFN-γ，后者是經(jīng)常介導(dǎo)Cac6,8的細(xì)胞因子。IAC的表現(xiàn)除了抗原特異性CD8+T細(xì)胞受體啟動(dòng)外，還需要T細(xì)胞而非脂肪細(xì)胞內(nèi)特異性的IFNAR1信號(hào)傳導(dǎo)。細(xì)胞溶解效應(yīng)分子穿孔素的缺失或淋巴器官T細(xì)胞出口的藥物阻斷均不能阻止惡病質(zhì)的發(fā)生，這提示了除經(jīng)典的CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性以外的其他機(jī)制。

 

      本實(shí)驗(yàn)多次運(yùn)用了ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，其中亞科因生物（Abbkine）的ELIKINE^TM試劑盒作為一個(gè)重點(diǎn)檢測(cè)指標(biāo)來使用，即：KET0004檢測(cè)小鼠血液中的游離甲狀腺素，使用方法便捷，效果卓越。

 

      Abbkine專注于免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域，致力于創(chuàng)新和研發(fā)各類抗體、蛋白質(zhì)、分析試劑與試劑盒，以期成為生命科學(xué)研究發(fā)展、藥物研發(fā)等領(lǐng)域的關(guān)鍵推動(dòng)者。在這里，我們?yōu)槟诗I(xiàn)蛋白和免疫研究用戶最喜愛的產(chǎn)品，從免疫學(xué)基礎(chǔ)產(chǎn)品，如蛋白提取定量，到免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參標(biāo)簽抗體、一抗及二抗等；細(xì)胞研究用戶最喜愛的產(chǎn)品，從用于檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的染料及試劑盒，細(xì)胞器提取試劑盒，細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)染色示蹤及細(xì)胞代謝檢測(cè)產(chǎn)品，到用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞因子及蛋白類檢測(cè)試劑盒，只為助力您的研究事業(yè)！

 

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