觸珠蛋白是一種急性期蛋白，在感染和炎癥期間，大多數(shù)哺乳動(dòng)物的血液中都會(huì)升高。Passler等人報(bào)告稱，暴露于脂多糖后，羊駝的血清觸珠蛋白水平會(huì)升高，從而誘導(dǎo)急性期反應(yīng)。

該檢測(cè)使用親和純化的羊駝?dòng)|珠蛋白抗體進(jìn)行固相（微量滴定孔）固定，使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的羊駝接觸珠蛋白抗體檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋樣品在微量滴定孔中孵育45分鐘。隨后清洗這些井。加入HRP綴合物并孵育45分鐘。這導(dǎo)致觸珠蛋白分子被夾在固定化抗體和檢測(cè)抗體之間。然后洗滌孔以去除未結(jié)合的HRP綴合物，加入TMB并孵育20分鐘。如果存在觸珠蛋白，則會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色。通過(guò)加入Stop溶液停止顯色，使顏色變?yōu)辄S色，并在450nm處測(cè)量吸光度。觸珠蛋白的濃度與吸光度成正比，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。

艾美捷Life Diagnostics試劑盒提供的材料和組分：

包被血紅蛋白抗體的96孔板（12條8孔條）

辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，11毫升

血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（凍干）

20倍洗滌液；TBS50-20，50毫升

10倍稀釋液；YD25-10，25毫升

四甲基聯(lián)苯胺（TMB），TMB11-1，11毫升

終止液，SS11-1，11毫升

未提供但必需的材料：

移液器和吸頭

蒸餾水或去離子水

聚丙烯或玻璃試管

渦旋混合器

吸水紙或紙巾

板式孵育器/振蕩器

板式洗板機(jī)

能夠測(cè)量450納米吸光度的板式閱讀器

曲線擬合軟件

儲(chǔ)存：

未開(kāi)封的試劑盒應(yīng)存放在2-8°C，微孔板應(yīng)存放在密封袋中，并放入干燥劑。試劑盒自購(gòu)買之日起六個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。

一般指導(dǎo)：

所有試劑在使用前應(yīng)放置至室溫。

當(dāng)對(duì)指導(dǎo)有完全理解并遵循良好的實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，將獲得可靠和可重復(fù)的結(jié)果。

洗滌程序至關(guān)重要。洗滌不充分會(huì)導(dǎo)致精度差和吸光度讀數(shù)虛高。

實(shí)驗(yàn)室溫度會(huì)影響吸光度讀數(shù)。我們的ELISA試劑盒使用設(shè)置在150轉(zhuǎn)/分鐘和25°C的振蕩孵育器進(jìn)行校準(zhǔn)。在更低溫度下進(jìn)行檢測(cè)將導(dǎo)致吸光度值降低。

稀釋液準(zhǔn)備：

稀釋液作為10倍濃縮液提供。使用前，估算實(shí)驗(yàn)所需的最終稀釋液體積，并將10倍濃縮液與九倍蒸餾水或去離子水混合稀釋。

洗滌液準(zhǔn)備：

洗滌液作為20倍濃縮液提供。使用前，將瓶中內(nèi)容物（50毫升）與950毫升蒸餾水或去離子水混合稀釋。

標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：

按照瓶簽上的說(shuō)明重新溶解凍干的標(biāo)準(zhǔn)品。重新溶解的標(biāo)準(zhǔn)品在4°C下穩(wěn)定一天，但如果打算將來(lái)使用，應(yīng)分裝并存放在-20°C或更低的溫度下。

標(biāo)記6個(gè)聚丙烯或玻璃試管：200、100、50、25、12.5、6.25 ng/ml。

在標(biāo)記為200 ng/ml的試管中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品瓶簽上的詳細(xì)說(shuō)明準(zhǔn)備200 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。

在標(biāo)記為100、50、25、12.5、6.25 ng/ml的試管中分別加入250 ?l的稀釋液。

通過(guò)將標(biāo)記為100 ng/ml的試管中的250 ?l 200 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品與250 ?l稀釋液混合稀釋，準(zhǔn)備100 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。

類似地，通過(guò)兩倍連續(xù)稀釋準(zhǔn)備其余的標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品準(zhǔn)備：

我們發(fā)現(xiàn)健康羊駝血清中的血紅蛋白水平大約為4 mg/ml。為了獲得在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的值，我們建議使用以下程序?qū)⒚總€(gè)待測(cè)樣品稀釋16,000倍：

分別向試管中加入198 ?l和636 ?l的1x稀釋液。

將2.0 ?l的血清/血漿樣品吸入含有198 ?l 1x稀釋液的試管中并混合。這提供了100倍的稀釋。

將4.0 ?l的100倍稀釋樣品與第二管中的636 ?l 1x稀釋液混合。這提供了樣品的16,000倍稀釋

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：

以下顯示了一個(gè)典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以450納米處的吸光度作為Y軸，相對(duì)于X軸上的血紅蛋白濃度。這個(gè)曲線僅用于說(shuō)明。

參考文獻(xiàn)：

1. Passler T. et al., Evaluation of methods to improve the diagnosisof systemic inflammation in alpacas. J Vet Intern Med. 27:970-976 (2013).

Life Diagnostics 專注于研發(fā)和生產(chǎn)臨床前研究以及動(dòng)物醫(yī)學(xué)診斷相關(guān)的ELISA試劑盒、純化的生物標(biāo)志物和抗體等產(chǎn)品。產(chǎn)品覆蓋心血管疾病、急性期反應(yīng)、免疫毒性和免疫學(xué)標(biāo)志物等研究領(lǐng)域，主要應(yīng)用于小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、猴和雞等物種。艾美捷科技是Life Diagnostics的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。