乳鐵蛋白是一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，存在于牛奶、其他分泌液和血液中。作為宿主防御的一部分，它具有抗菌和抗炎活性。它是牛乳腺炎的生物標(biāo)志物。1,2乳鐵蛋白水平從正常牛奶中的低于0.05mg/ml到乳腺炎動物牛奶中的高于8mg/ml不等。

該測定使用親和純化的奶牛乳鐵蛋白抗體進(jìn)行固相（微量滴定孔）固定，使用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的奶牛乳鐵蛋白抗體進(jìn)行檢測。將標(biāo)準(zhǔn)樣品和稀釋樣品在微量滴定孔中孵育45分鐘。隨后清洗這些井。加入HRP偶聯(lián)物并孵育45分鐘。這導(dǎo)致乳鐵蛋白小分子夾在固定抗體和檢測抗體之間。然后洗滌孔以去除未結(jié)合的HRP綴合物，加入TMB并孵育20分鐘。如果乳鐵蛋白存在，則會出現(xiàn)藍(lán)色。通過加入Stop溶液停止顯色，將顏色變?yōu)辄S色，并在450nm處測量吸光度。乳鐵蛋白的濃度與吸光度成正比，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出。

艾美捷Life Diagnostics標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為凍干形式。根據(jù)瓶簽上的指示加入蒸餾水或去離子水的體積，并輕輕混合直至溶解（如果打算將來使用，重新溶解的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分裝并存放在-20°C或更低的溫度下）。

標(biāo)記7個(gè)聚丙烯或玻璃試管為100、50、25、12.5、6.25、3.13和1.56 ng/ml。

在標(biāo)記為100 ng/ml的試管中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品瓶簽上的詳細(xì)說明，用1x稀釋液稀釋重新溶解的標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備100 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。

在標(biāo)記為50、25、12.5、6.25、3.13和1.56 ng/ml的試管中分別加入250 ?l的1x稀釋液。

通過將標(biāo)記為50 ng/ml的試管中的250 ?l 100 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品與250 ?l稀釋液混合稀釋，準(zhǔn)備50 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。

類似地，通過兩倍連續(xù)稀釋準(zhǔn)備其余的標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品準(zhǔn)備：

牛奶：為了獲得最佳結(jié)果，牛奶應(yīng)處理成脫脂奶或乳清。脫脂奶可以通過在4°C下以>3000g離心牛奶15分鐘來獲得。乳清是通過用冰醋酸將脫脂奶調(diào)節(jié)至pH 4.5，然后離心并使用5M NaOH將上清液的pH調(diào)節(jié)回6.5 – 7.5來準(zhǔn)備的。為了獲得在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的值，我們建議每個(gè)待測樣品使用以下程序進(jìn)行10,000倍稀釋。

向兩個(gè)試管中分別加入495 ?l的1x稀釋液。

將5.0 ?l樣品吸入第一個(gè)試管并混合。這提供了100倍的稀釋。

將5.0 ?l的100倍稀釋樣品與第二個(gè)試管中的495 ?l稀釋液混合。這提供了10,000倍的稀釋。 血清：正常血清中的乳鐵蛋白水平大約為100 ng/ml。為了在檢測前避免基質(zhì)效應(yīng)，樣品必須稀釋20倍或更多。

結(jié)果計(jì)算：

使用曲線擬合軟件，通過將標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值與濃度的常用對數(shù)對數(shù)圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合到四參數(shù)邏輯回歸（4PL）方程（x軸=濃度的常用對數(shù)），并從標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品的濃度（記得從反對數(shù)中得到濃度）。

將得出的濃度乘以稀釋因子，以確定血清或血漿樣品中的實(shí)際濃度。

如果樣品的A450值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋樣品并重新檢測。

參考文獻(xiàn)：

1. Kawai K, Hagiwara S, Anri A, Nagahata H. Lactoferrinconcentration in milk of cow clinical mastitis. Vet Res Commun.23(7):391-398 (1999)

2. Harmon RJ et’al. Changes in lactoferrin, immunoglobulin G, cowserum albumin, and a-lactalbumin during acute experimentaland natural coliform mastitis in cows. Infection and Immunity.13:533-542 (1976)

Life Diagnostics 專注于研發(fā)和生產(chǎn)臨床前研究以及動物醫(yī)學(xué)診斷相關(guān)的ELISA試劑盒、純化的生物標(biāo)志物和抗體等產(chǎn)品。產(chǎn)品覆蓋心血管疾病、急性期反應(yīng)、免疫毒性和免疫學(xué)標(biāo)志物等研究領(lǐng)域，主要應(yīng)用于小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、猴和雞等物種。艾美捷科技是Life Diagnostics的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。