自噬（autophagy）是在真核細(xì)胞中，過量或異常的細(xì)胞器被雙膜泡隔離并交付給溶酶體/液泡后被降解，回收利用細(xì)胞性物質(zhì)及清除受損細(xì)胞器或有害的蛋白質(zhì)的過程。自噬的過程包括隔離膜（isolation membrane）或自噬前體（pre-autophagosome）的形成及延伸、自噬體（autophagosome）的形成、自噬體和溶酶體融合后形成自噬溶酶體（autolysosome），最終胞內(nèi)物質(zhì)降解，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物如氨基酸、脂肪酸等可被細(xì)胞再利用。

自噬在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用：①應(yīng)對外源性刺激，自身降解重新獲得生長所需營養(yǎng)物質(zhì)。②細(xì)胞自我更新，降解胞內(nèi)衰老蛋白和細(xì)胞器后重新合成蛋白和細(xì)胞器。③防御性清除胞內(nèi)受損大分子物質(zhì)，維持細(xì)胞正常功能。

既然自噬對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)如此重要，那么，自噬檢測怎么做呢？說到這里就不得不提到公認(rèn)的自噬標(biāo)志物——微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3（microtubule-associated-proteinlight-chain-3，LC3）。正常情況下，LC3以未脂化的可溶性形式存在于胞漿中，被稱為LC3-Ⅰ，其分子量為18kDa。自噬形成時(shí)，LC3-Ⅰ酶解轉(zhuǎn)化成為膜型LC3，又被稱為LC3-Ⅱ，其分子量為16kDa。LC3Ⅱ在聚丙烯酰胺凝膠上表現(xiàn)出的遷移率高于LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ與噬小體/自噬溶酶體的數(shù)量呈正相關(guān)，所以LC3-Ⅱ被廣泛地應(yīng)用于定量細(xì)胞自噬的活性。

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LC3與綠色熒光蛋白（GFP）結(jié)合成LC3-GFP顯示出與LC3相同的過程，并且可通過監(jiān)控液泡輸送和GFP-LC3后續(xù)的分解而示蹤自噬通量。當(dāng)自噬通量正常，存在于自噬體內(nèi)部的GFP-LC3在自噬體膜融解且暴露于液泡水解酶的內(nèi)容物被裂解。GFP-LC3的蛋白水解可釋放出一個(gè)完整的GFP部分，因其對降解有相對抗性，可作為自噬產(chǎn)物累積在液泡。自由的GFP水平增加可被檢測且可通過Western印跡分析進(jìn)行定量，并與自噬率相關(guān)。GFP是酸敏感型GFP蛋白，由于自噬溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境，可以導(dǎo)致pH下降、GFP淬滅，因此，GFP的強(qiáng)弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度。除了以上LC3-II檢測試劑盒，Cell Biolabs當(dāng)然還可以提供GFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒（cat#CBA-401）：

左側(cè)是pCMV-GFP對照質(zhì)粒；右側(cè)是pCMV-GFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒

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