PARP是一種在DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、凋亡和免疫功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。PARP-1招募合成DNA酶來激活DNA修復(fù)。PARP-2維持基因組穩(wěn)定性并修復(fù)DNA單鏈斷裂(SSB。PARP-1和PARP-2在DNA修復(fù)系統(tǒng)中具有相同的調(diào)節(jié)機(jī)制，但它們與DNA斷裂結(jié)合的機(jī)制不同。PARP抑制劑與PARP酶結(jié)合后，PARP蛋白會(huì)與DNA損傷位點(diǎn)結(jié)合形成PARP-DNA復(fù)合物而無法分離，這就造成了其他DNA修復(fù)蛋白無法參與修復(fù)過程，甚至?xí)斐蛇M(jìn)一步形成DNA的雙鏈損傷，這就是制劑所造成的PARP Trap效應(yīng)。由于PARP Trap對(duì)腫瘤細(xì)胞的具有更強(qiáng)的殺傷效應(yīng)，因此，對(duì)抑制劑的PARP Trap能力檢測(cè)變的非常重要。  

迄今為止，四種PARP抑制劑(olaparib、rucaparib、niraparib和talazoparib)已獲得FDA批準(zhǔn)用于各種適應(yīng)癥，如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌患者。PARP抑制劑對(duì)PARP家族成員和PARP-DNA捕獲效力表現(xiàn)出不同的抑制作用。這些特性與獨(dú)特的安全性/有效性特征相關(guān)。 

近期，國(guó)際團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer Therapeutics（AACR）在線發(fā)表了題為"Venadaparib Is a Novel and Selective PARP Inhibitor with Improved Physicochemical Properties, Efficacy, and Safety"的文章，合成了新型強(qiáng)效PARP抑制劑維那達(dá)帕利(Venadaparib，也稱為IDX-1197或NOV140101)，評(píng)估了Venadaparib對(duì)PARP酶、PAR形成和PARP捕獲活性的療效，以及對(duì)BRCA突變細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，還建立了體外和體內(nèi)模型，以研究藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)、療效和毒性。Venadaparib將有望成為下一代PARP抑制劑。Venadaparib的療效和安全性的Ib/IIa期研究已經(jīng)啟動(dòng)。  

艾美捷科技作為BPS Bioscience中國(guó)區(qū)代理，非常榮幸能夠作為供應(yīng)商為該項(xiàng)研究提供高品質(zhì)PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584），為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的科研探索貢獻(xiàn)一份力量。  

BPS Bioscience特別的PARPtrap檢測(cè)試劑盒，非常適用于藥物研發(fā)和高通量篩選應(yīng)用中，篩選增強(qiáng)PARP/DNA固定能力的小分子化合物。

* 以上產(chǎn)品，均為熒光偏振測(cè)定法（fluorescence polarization, FP）

引用產(chǎn)品：

該項(xiàng)研究中使用了艾美捷科技代理的BPS Bioscience的PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584），用于檢測(cè)PARP1捕獲檢測(cè)。  

【實(shí)驗(yàn)技術(shù)，延伸解讀】

① PARP trapping assay，PARP捕獲檢測(cè)試驗(yàn)

Venadaparib對(duì)重組人PARP-1酶的DNA結(jié)合活性的影響是通過BPS Bioscience進(jìn)行的體外酶活性測(cè)定來確定的。PARPtrap酶活性測(cè)定試劑盒（目錄號(hào)80584；BPS Bioscience）用于該測(cè)定。Venadaparib、olaparib、rucaparib、niraparib、talazoparib和veliparib在濃度范圍為0.000026至5μmol/L進(jìn)行了檢測(cè)。根據(jù)制造商的說明進(jìn)行酶反應(yīng)后，使用激發(fā)波長(zhǎng)為485nm和發(fā)射波長(zhǎng)為528nm的M1000微孔板閱讀器（Tecan Infinite）測(cè)量了熒光信號(hào)。 

② Enzymatic assay against recombinant PARP enzymes，重組PARP酶的酶學(xué)檢測(cè)

venadaparib對(duì)重組人PARP酶（PARP-1、PARP-2、PARP-3、TNKS-1、TNKS-2、PARP-6、PARP-7、PARP-8、PARP-10、PARP-11、PARP-12、PARP-14和PARP-15，均采購(gòu)自BPS Bioscience）進(jìn)行了體外酶活性分析。Venadaparib在濃度范圍為0.000005至10μmol/L進(jìn)行檢測(cè)。采用Synergy 2微孔板讀數(shù)儀（BioTek Instruments）測(cè)量了發(fā)光輸出。使用Prism 9（GraphPad Software）確定了IC50。 

【產(chǎn)品解讀】

PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584）

PARPtrap Assay Kit for PARP1旨在利用熒光偏振（FP）高通量篩選測(cè)定法測(cè)量PARP1/DNA復(fù)合物形成。PARP1以其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域而聞名。與DNA的結(jié)合激活PARP1，在NAD+存在的情況下，PARP1會(huì)對(duì)自身進(jìn)行核糖基化（自動(dòng)核糖基化），這導(dǎo)致核糖聚合物的負(fù)電荷積累，從而導(dǎo)致PARP1從DNA上解離。然而，在一些抑制劑的存在下，PARP仍然與DNA結(jié)合，這種現(xiàn)象稱為困擾。已經(jīng)證明，被困的PARP-DNA復(fù)合物對(duì)癌細(xì)胞具有高度毒性，因此這類抑制劑對(duì)癌癥治療可能是可取的。  

PARPtrap Assay Kit for PARP1的關(guān)鍵是熒光標(biāo)記的寡核苷酸雙鏈。在未發(fā)生核糖基化的情況下，PARP1與熒光探針結(jié)合，形成大的復(fù)合物，并導(dǎo)致高度偏振光的發(fā)射。然而，在自動(dòng)核糖基化后，PARP1從寡核苷酸雙鏈解離，然后自由旋轉(zhuǎn)，發(fā)射較少偏振光。添加PARP1抑制劑會(huì)導(dǎo)致PARP1被困在熒光寡核苷酸雙鏈中，并以劑量依賴的方式增加FP信號(hào)。 

PARPtrap Assay Kit for PARP1是一種熒光偏振均相分析法。FP信號(hào)是使用能夠測(cè)量熒光偏振的熒光微孔板讀數(shù)器來測(cè)量的。   

產(chǎn)品組分：（96次規(guī)格，為例）

實(shí)驗(yàn)步驟（簡(jiǎn)易漢化，請(qǐng)務(wù)必以英文原版說明書為準(zhǔn)）：

• 所有樣本和對(duì)照應(yīng)進(jìn)行重復(fù)操作。

• 實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括一個(gè)“空白”、一個(gè)“參考”，一個(gè)“低FP對(duì)照”和一個(gè)“高FP對(duì)照”。

1. 準(zhǔn)備Master Mix（每孔20 ul）：N孔 x（6 μl 5倍PARPtrap測(cè)定緩沖液 + 1 ul 25 nM熒光標(biāo)記的DNA + 13 μl蒸餾水）。例如，對(duì)于20個(gè)孔，準(zhǔn)備：120 μl 5倍PARPtrap測(cè)定緩沖液 + 20 ul 25 nM熒光標(biāo)記的DNA + 260 μl蒸餾水。

2. 通過將1份5倍PARPtrapTM測(cè)定緩沖液稀釋為4份蒸餾水，制備1倍PARPtrapTM測(cè)定緩沖液。只稀釋所需的試劑量。

3. 準(zhǔn)備抑制劑溶液。

   如果抑制劑化合物溶解在DMSO中，將其在水中稀釋10倍，使得所有樣本中DMSO的最終濃度為1%。如果化合物溶解在除DMSO以外的稀釋劑中，請(qǐng)使用該稀釋劑制備對(duì)照稀釋劑溶液。

4. 準(zhǔn)備酶： 在冰上解凍PARP1酶。簡(jiǎn)短離心含有酶的管子，使其完全恢復(fù)管子中的全部?jī)?nèi)容。用1倍PARPtrap測(cè)定緩沖液稀釋酶至約0.5 ng/ul。

   注意：PARP1酶對(duì)凍結(jié)/解凍很敏感。避免多次凍結(jié)/解凍。雖然我們不建議這樣做，但如果不一次使用所有試劑孔，請(qǐng)計(jì)算所需的PARP1量，只稀釋足夠?qū)嶒?yàn)所需的量，并將剩余的未稀釋PARP1酶分裝并儲(chǔ)存在-80°C。不要再次使用解凍的分裝液或稀釋的酶。

5. 按照下表向“高FP對(duì)照”，“低FP對(duì)照”，“測(cè)試抑制劑”和“參考”孔中加入反應(yīng)的每個(gè)組分：

6. 向標(biāo)記為“空白”的孔中加入12 ul 5倍PARPtrap測(cè)定緩沖液 + 28 ul蒸餾水 + 5 ul稀釋劑（例如DMSO 10%）。

   注意，“空白”包含反應(yīng)的緩沖成分，但不包含熒光探針或PARP1酶。

   備注：

• 參考：一個(gè)缺乏PARP1的陰性對(duì)照，其中所有熒光DNA以自由形式存在，F(xiàn)P最低（與空白不同，空白中沒有熒光探針）。參考用于進(jìn)行計(jì)算。

• 高FP對(duì)照：不添加NAD+的條件，因此所有與熒光DNA結(jié)合的PARP1不能發(fā)生核糖基化反應(yīng)，仍與DNA結(jié)合，導(dǎo)致FP達(dá)到試劑盒允許的最大值。

• 低FP對(duì)照：在存在NAD+的情況下，所有與熒光DNA結(jié)合的PARP1都被允許發(fā)生核糖基化反應(yīng)并與DNA解離，導(dǎo)致主要為自由DNA和低FP。這是在沒有抑制劑的情況下對(duì)應(yīng)于最大PARP1核糖基化活性的條件。

• 測(cè)試抑制劑：FP將與抑制活性水平和結(jié)果陷阱在熒光核苷酸雙鏈上成正比增加。

• 稀釋劑溶液：與用于制備測(cè)試抑制劑的DMSO濃度相同，但不含抑制劑。

7. 室溫孵育30-60分鐘。

8. 向標(biāo)記為“高FP對(duì)照”的孔中加入5 ul蒸餾水。

9. 向“空白”、“低FP對(duì)照”、“測(cè)試抑制劑”和“參考”孔中加入5 ul 10倍NAD+，啟動(dòng)PARP1酶反應(yīng)。不要向“高FP對(duì)照”中加入NAD+。 這將使最終反應(yīng)體積達(dá)到50 ?l。 室溫孵育板子60分鐘。

10. 使用能夠在470-480 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)激發(fā)和在508-528 nm范圍內(nèi)檢測(cè)發(fā)射光的微孔板讀數(shù)器讀取樣品的熒光極化值。

    從所有值中減去空白值。

References

1. Murai, J., et al. Molecular Cancer Therapeutics 2014. 13:433-443.

2. Murai, J., et. al. Cancer Research 2012. 72:5588-5599.

3. Zandarashvili, L., et al. Science 2020. 368(6486): eaax6367.

相關(guān)產(chǎn)品：

BPS Bioscience，激酶研究專家，活性酶、激酶活性/抑制劑篩選檢測(cè)試劑盒、慢病毒等，產(chǎn)品涉及臨床前藥物開發(fā)過程的每個(gè)階段，包括磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶（PARP）等熱門指標(biāo)的蛋白酶及酶活/抑制劑篩選檢測(cè)試劑盒。詳情清咨詢艾美捷科技：http://m.zihai029.com/