流式抗體熒光選擇技巧：

在進(jìn)行流式細(xì)胞儀多色分析時(shí)，如果想得到理想的分析結(jié)果，就需要選擇好抗體的熒光搭配。常考慮的影響因素有以下幾點(diǎn)：

1.熒光素的熒光強(qiáng)度：

一個(gè)特定抗體，能否區(qū)分陰性與陽(yáng)性結(jié)果，靠的是抗體上結(jié)合的熒光素標(biāo)記。每一種熒光素的光量子釋放能力不同，相對(duì)熒光強(qiáng)度不一樣，一般用染色指數(shù)（staining index）來(lái)比較不同熒光標(biāo)記的光信號(hào)強(qiáng)度。染色指數(shù)是陽(yáng)性信號(hào)和陰性信號(hào)差異與陰性峰分布寬度比值，是判斷該熒光染料辨別弱陽(yáng)性表達(dá)的能力。因此，對(duì)于特定的單克隆抗體，由于使用了不同的熒光素標(biāo)記，其陰性細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞的S/N比值（信噪比）可以相差4-6倍。一般來(lái)講，熒光信號(hào)由強(qiáng)到弱的的排序是：PE>APC>PE-Cy5>PERCP-Cy5.5>FITC>PERCP。

2.熒光素標(biāo)記效率：

抗體上標(biāo)記熒光素的數(shù)量（F/P）值也會(huì)影響相對(duì)熒光強(qiáng)度。每一個(gè)抗體上可標(biāo)記幾個(gè)FITC或PERCP分子（通常為2-9個(gè)），而APC和PE的標(biāo)記量約為每個(gè)抗體標(biāo)記一個(gè)熒光分子。FITC為小分子化合物，而PE，PERCP和APC則是分子量較大的熒光蛋白。受熒光標(biāo)記物的化學(xué)性質(zhì)要求限制，IGM型抗體通常只用小分子的熒光素進(jìn)行標(biāo)記，如FITC、TEXAS RED、Cy3和Cy5。

3.抗原表達(dá)豐度：

高表達(dá)的抗原幾乎可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)，而較低表達(dá)的抗原則需要用較高亮度的熒光素標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到有效區(qū)分陽(yáng)性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞的目的。

4.細(xì)胞自發(fā)熒光：

每個(gè)細(xì)胞群體都帶有不同水平的自發(fā)熒光，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光在高波長(zhǎng)范圍里（>600nm）迅速降低，所以在檢測(cè)自發(fā)熒光水平高的細(xì)胞時(shí)，使用發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光染料（比如APC）可以得到較好的檢測(cè)結(jié)果。

5.非特異性結(jié)合

有些熒光標(biāo)記的抗體會(huì)表現(xiàn)出低水平的非特異性結(jié)合，就會(huì)造成陰性細(xì)胞的熒光水平升高。

常見(jiàn)流式抗體熒光染料簡(jiǎn)介：

1) 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）：PE是從紅藻中分離純化獲得的一種常見(jiàn)染料，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出橙黃色熒光，最大發(fā)射波長(zhǎng)為575 nm。PE具有吸光性能好和光量子產(chǎn)率高的特點(diǎn)，可用于標(biāo)記表達(dá)水平較低的蛋白。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，PE標(biāo)記的抗體適用于所有配備488 nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀。

2) PE-Cy5：PE-Cy5是一種復(fù)合染料，屬于藻紅蛋白偶聯(lián)物，在此類(lèi)復(fù)合染料中，激發(fā)能量可從PE傳遞到Cy5上，最大發(fā)射波長(zhǎng)為667 nm。由于PE-Cy5與FITC、PE在光譜上重疊范圍較少，熒光干擾少，因此實(shí)驗(yàn)中常將PE-Cy5與FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不適合與APC搭配使用，兩者熒光重疊大。

3)PE-Cy5.5：PE-Cy5.5也是一種復(fù)合染料，能量從PE傳遞到Cy5.5上，最大發(fā)射波長(zhǎng)為694 nm。同PE-Cy5不一樣，PE-Cy5.5與FITC、PE、APC間熒光干擾小，可搭配使用，且其熒光強(qiáng)度要優(yōu)于PE-Cy5。

4) PE-Cy7：復(fù)合染料，最大發(fā)射波長(zhǎng)為785 nm。PE-Cy7與FITC無(wú)光譜重疊，與APC重疊也較少，因此其可與FITC、PE、APC搭配使用。在實(shí)驗(yàn)中需要注意，PE-Cy7的光淬滅性很強(qiáng)，需要絕對(duì)避光環(huán)境。

5) PerCP-Cy5.5：復(fù)合染料，最大發(fā)射波長(zhǎng)為695 nm。PerCP-Cy5.5光量子產(chǎn)率高，可用于表達(dá)水平較低物質(zhì)的檢測(cè)，與PerCP-Cy5.5相反，PerCP的光量子產(chǎn)率較低，適用于表達(dá)水平較高物質(zhì)的檢測(cè)，在雙激光管儀器上與APC共同檢測(cè)時(shí)，需要做補(bǔ)償調(diào)節(jié)，但比PerCP補(bǔ)償少。

6) PI/7-AAD：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為617 nm和647 nm，是常見(jiàn)的熒光染料，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，可用于鑒別死、活細(xì)胞。在大部分流式細(xì)胞儀上，PI在FL2或FL3通道檢測(cè)，7-AAD在FL3通道檢測(cè)。7-AAD同PI 有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品。

7) 別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）：APC最大發(fā)射波長(zhǎng)為660 nm，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備氦氖激光器的流式細(xì)胞儀，檢測(cè)通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是經(jīng)典3色搭配。

8) Cy5：Cy5屬于小分子染料，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為670 nm，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備633 nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀，檢測(cè)通道一般是FL4通道。除流式細(xì)胞術(shù)外，Cy5同樣適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)。需注意的是，Cy5與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的非特異性結(jié)合多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

9) 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）：FITC是應(yīng)用最為廣泛的一種熒光素，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出明亮的黃綠色熒光，最大發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。FITC的熒光強(qiáng)度受PH影響較大，常隨著PH的降低而減弱，因此，在使用FITC時(shí)需格外注意溶液的酸堿度。

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