哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院David Pépin和美國瀕危野生動(dòng)物保護(hù)與研究中心William F. Swanson的研究證據(jù)表明，用腺病毒（AAV）載體傳遞一種AMH轉(zhuǎn)基因進(jìn)行單一的肌肉注射（IM）治療，可對(duì)家貓產(chǎn)生長期的避孕效果。對(duì)治療后的家貓進(jìn)行了兩年多的隨訪，在此期間監(jiān)測轉(zhuǎn)基因表達(dá)、抗轉(zhuǎn)基因抗體和生殖激素。在兩次交配研究中測量了交配行為和繁殖成功。此外，AMH的異位表達(dá)不會(huì)損害性類固醇或發(fā)情循環(huán)，但會(huì)阻止繁殖誘導(dǎo)的排卵，從而導(dǎo)致母貓安全持久的避孕。在本研究中使用了AAV9在成年家貓中傳遞AMH轉(zhuǎn)基因（稱為fcMISv2）。結(jié)果表明，這種避孕措施可以防止繁殖誘導(dǎo)的排卵，導(dǎo)致完全不育，并可能構(gòu)成一種安全和持久的策略來控制家貓的繁殖。

相關(guān)研究內(nèi)容以題為“Durable contraception in the female domestic cat using viral-vectored delivery of a feline anti-Müllerian hormone transgene”的論文近期發(fā)表在《Nature Communications》上。

圖1 貓?zhí)禺愋訟MH轉(zhuǎn)基因的克隆及小鼠AAV9- fcMISv2的驗(yàn)證

本研究利用貓基因組8.0版不完整AMH序列構(gòu)建了第一代貓轉(zhuǎn)基因fcMISv1，為了將AMH載體避孕適應(yīng)于家貓。用食肉動(dòng)物的一致序列填補(bǔ)了AMH序列中的空白。隨后，基于家貓基因組中AMH序列完整的9.0版本，獲得了第二代貓AMH轉(zhuǎn)基因fcMISv2（圖1a）。純化和酶裂解的FLAG-fcMISv1和FLAG-fcMISv2都能在胎鼠泌尿生殖嵴生物測定中誘導(dǎo)Müllerian管的消退（圖1b）。AAV9治療后一個(gè)月，發(fā)現(xiàn)AMH蛋白在一些組織中表達(dá)，包括四頭肌和腹壁肌肉，腹膜器官如腎、脾、胰腺和肝臟（圖1c），在這些地方AMH蛋白被內(nèi)源性蛋白酶有效地切割，導(dǎo)致血液中的水平高于生理水平（圖1d）。治療4周后，用AAV9-fcMISv2 5e12 vg/kg或AAV9-fcMISv21e13 vg/kg處理的小鼠卵巢小于AAV9-empty 5e12 vp/kg組小鼠（圖1e)。與對(duì)照組相比，AAV9-fcMISv2處理小鼠的卵巢原發(fā)性、繼發(fā)性和有腔卵泡顯著減少（圖1f）。

圖2 家貓注射AAV9-fcMISv2的時(shí)間線和安全性研究

用AAV9-fcMISv2 (5e12 vg/kg，低劑量；1e13 vg/kg，高劑量）或AAV9-empty 5e12 vp/kg，對(duì)照；圖2a）治療9只貓（每組3只）。采用q-PCR方法檢測體液中病毒的脫落情況發(fā)現(xiàn)，在第2天的血液中很容易被檢測到病毒基因組，并在2個(gè)月內(nèi)保持升高，然后在3-4個(gè)月期間迅速下降，這可能反映了受感染細(xì)胞的更替（圖2b）。在第1天的尿液中可檢測到病毒脫落，并在7天內(nèi)穩(wěn)步下降，而口腔拭子和糞便樣本的測量結(jié)果在個(gè)體和組間差異更大。利用純化的重組FLAG-fcMISv2蛋白，開發(fā)了一種直接抗原-抗體捕獲ELISA，用于檢測家貓血清中的抗fcMISv2IgG（圖2c）。在給予AAV9-fcMISv2載體的6只貓中均未檢測到抗fcMISv2抗體（圖2d）。為了評(píng)估AAV9-fcMISv2治療的避孕潛力，在治療后8個(gè)月和20個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)啟動(dòng)了兩個(gè)為期4個(gè)月的交配試驗(yàn)（圖2a），在這兩項(xiàng)試驗(yàn)中，對(duì)照組每窩生下2-4只健康的小貓；而經(jīng)AAV9-fcMISv2治療的貓沒有在試驗(yàn)中分娩，在每周超聲檢查中也未觀察到妊娠囊或胎兒。

圖3 家貓注射AAV9-fcMISv2后的生殖激素

血清中循環(huán)AMH水平穩(wěn)定，在第一年逐漸下降，最終在第二年達(dá)到穩(wěn)定水平（圖3a）。實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到AAV9-fcMISv2治療后貓的抑制素B顯著下降（圖3b），這表明竇前和早期竇前卵泡激素可能不受超出生理水平AMH的影響。可能是由于有規(guī)律的發(fā)情周期，對(duì)照組和高劑量AAV9-fcMISv2組在治療后均出現(xiàn)雌二醇（E2）糞便排泄顯著升高（圖3c）。所有組在治療前和治療后的發(fā)情期頻率沒有觀察到差異（圖3d），表明E2的循環(huán)竇卵泡分泌不受超出生理水平AMH的影響。與過渡期相比，經(jīng)低、高劑量AAV9-fcMISv2治療后的貓促黃體生成素（LH）水平升高，但對(duì)照組沒有升高（圖3e）。治療后，低、高劑量組的平均孕酮那個(gè)（P4）濃度均顯著降低，而對(duì)照組在治療前和治療后組之間沒有差異（圖3f）。這些結(jié)果表明，接受AAV9-fcMISv2治療的貓存在輕度高促性腺激素性性腺功能減退表型，P4降低，LH升高。高劑量AAV9-fcMISv2組的黃體周期頻率顯著降低，但在低劑量組或?qū)φ战M中沒有（圖3g)。綜上，這些結(jié)果表明，超出生理水平的AMH抑制了貓的排卵和/或黃體的形成，導(dǎo)致黃體期的頻率降低。

綜上所述，本研究使用IM傳遞一個(gè)含有貓AMH（fcMISv2）轉(zhuǎn)基因的AAV9載體，以評(píng)估其對(duì)母貓的繁殖周期、交配和繁殖力的影響。本研究結(jié)果與避孕密切相關(guān)，證明了通過AAV9-fcMISv2基因治療可以長久抑制排卵，預(yù)防懷孕，且對(duì)治療的母貓沒有明顯的不良健康影響。這些研究數(shù)據(jù)還表明，AMH可以抑制黃體期和排卵，而不影響E2水平及其對(duì)健康壽命的有益影響。因此，這種單劑量、非手術(shù)避孕方式可以作為手術(shù)絕育的可行替代方案，并為獸醫(yī)實(shí)踐、收容所和動(dòng)物控制項(xiàng)目提供一個(gè)快速和易于應(yīng)用的選擇，以實(shí)現(xiàn)母貓終身避孕。

文章來源：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-38721-0