血清制備

1.取血后，37oC 下，讓血液凝固 1 到 2 小時（不加抗凝劑）；

2.4oC 冰箱過夜（讓血塊固縮）；

3.當(dāng)血清自然析出后， 4oC，3000 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，分離血清，棄去不溶物；

4.將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，儲藏在-80oC。

ELISA

一、包被抗原

1.用 50mM 的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解 抗 原 ，使抗原濃度為 10-20 μg/ml，加 100 μl/孔到 96 孔酶標(biāo)板，4 oC 放置過夜。

2. 第二天棄去包被液后，用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 oC封閉 1 小時。

3. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC 孵育 2 小時。

4. PBST 洗滌 5 次后，加入 100μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗，37 oC 孵育 1 小時 。

5. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。

二、包被細(xì)胞

1.在 96 孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為 1 x 104 cells/well，37℃過夜培養(yǎng)。

2. 第二天用 PBS 洗滌培養(yǎng)板 2-3 次。

3. 加入 125 ?l/well 10% Formalin（1:10 稀釋）, 室溫下固定 15 min。

4. 用 ddH2O 洗滌培養(yǎng)板 3 次，并晾干，儲藏在 2-8oC 備用。

5. 用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 oC 封閉 1 小時。

6. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC 孵育 2 小時。

7. PBST 洗滌 5 次后，加入 100 μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗,37 oC 孵育 1 小時。

8. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。50mM 的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6 碳酸緩沖液,4℃，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸餾水稀釋至 100 ml。ABTS 作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)(10ml)：

0.2M

Na2HPO4

2.4ml

0.1M

檸檬酸 2.6ml

ddH2O

5ml

ABTS

5mg

H2O2(30%)

4ul（用前加入）

注意：

一般做倍比稀釋進(jìn)行檢測，需要有相應(yīng)的對照血清。

不同的顯色系統(tǒng)對應(yīng)不同的光吸收值。