一、E.coli/phage裂解液預(yù)吸附血清

1.將 E.coli /phage lysate 以 1:10-20 稀釋在 TBST 溶液中。

2.將 4 張 82mm 的 nitrocellulose membranes（NC）浸入稀釋后的 E.coli/ phagelysate 中，室溫下水平搖動 30 分鐘，取出 NC 并使膜瀝干。

3.用 50ml TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分鐘。

4.用濾紙輕輕吸去膜上的液體。

5.將膜放入 50ml 封閉液中，室溫下水平搖動最少 30 分鐘。

6.將膜從封閉液中取出，用 50ml TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分鐘。

7.將血清按 1:5 稀釋在 TBST 溶液中，將一張膜放入溶液中，37℃下輕輕水平搖動 10 分鐘。

8.從血清稀釋液中取出膜并丟棄,加入另外一張新膜,37℃下輕水平搖 10 分鐘.

9.重復(fù)步驟 8，直至所有 4 張膜都處理完。

10. 除去最后一張膜，收集血清（primary antibody），分裝成小份儲存于-80℃冰箱中待用。

注意：

該步處理過程是為了去除血清中能與細(xì)菌和噬菌體裂解蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗體，這樣可以減少假陽性率；

一抗不能反復(fù)凍融，化凍后不要再次冰凍，可放于 4℃作短暫保存。可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，則需要至少 10個病人血清進(jìn)行混合；

二、噬菌體篩選

1.準(zhǔn)備 NZY agar plates（至少用前 24 小時倒好），用前在 37℃培養(yǎng)箱中烘烤1-2 小時以去除水滴。

2.將過夜培養(yǎng)的 XL1-blue MRF’細(xì)菌 2000 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，將細(xì)菌溶解在10mM MgSO4 中，調(diào)整細(xì)菌濃度為 OD600=0.5。

3.融化 NZY top，并將 NZY top 放在 50℃水浴中。

4.將適量的 XL1-blue MRF’細(xì)菌溶液與一定稀釋度的 phage 文庫混合，37℃下共同作用 15 分鐘。直徑 90mm 平板：200?l XL1-blue 細(xì)菌+適量的 phage 文庫直徑 150mm 平板：600?l XL1-blue 細(xì)菌+適量的 phag 文庫（噬菌斑數(shù)量一般保持在 3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）

5.將步驟 4 中的混合液與 NZY top 溶液混合（200?l 混合液+3-4mlNZY top 溶液；600?l 混合液+8-10 ml NZY top 溶液），倒入到 NZY agar plates 中，室溫下放 10 分鐘左右，然后倒置放于 37℃下培養(yǎng)。

6.當(dāng)噬菌斑剛好可看到時（大約 5-8 小 時 ），從培養(yǎng)箱中拿出平板。

7.將 NC 放入 10mM IPTG 溶液中完全浸濕，在空中使膜瀝干，并做好 3 個不對稱的標(biāo)記。

8.將 IPTG 處理好的 NC 貼在平板上，不留氣泡，然后倒置放于 37℃下培 養(yǎng) 。

9.過夜培養(yǎng)后，第二天早上取出平板，用鑷子將膜輕輕掀起，注意不要將培養(yǎng)基粘在膜上。

10. 將膜放于 50ml TBST 溶液中，水平脫色搖床上震蕩洗膜 3 次，每次 10 分鐘。

11. 將膜放入 50ml 封閉液中，水平搖動，封閉 4-6 小時。

12. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊囊豢梗綋u動處理過夜。

13. 將膜放于 50ml TBST 溶液中，洗膜 3 次，每次 10 分鐘。

14. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊亩梗ǜ鱾€公司的二抗使用滴度不同），室溫水平搖動 1-2 小時。

15. 將膜放于 50ml TBST 溶液中，洗膜 3 次，每次 10 分鐘，最后用 50ml TBS溶液洗膜 15-20 分鐘，取出膜空氣中瀝干。

16. 將膜放入 BCIP-NBT 顯色液中避光顯色，水平搖動直到陽性斑點可見為止。

17. 從顯色液中取出膜放在 TBS 溶液中，空氣中使膜干燥。

18. 根據(jù)所做的標(biāo)記,將膜與平板對齊,將平板上對應(yīng)的陽性克隆區(qū)域的培養(yǎng)基挖出放入 500?l SM buffer 中,并加入 25 ml chloroform,4℃貯存（最多可貯 6 月）。

19. 第一輪篩選得到陽性克隆需要進(jìn)行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如第一輪篩選，只不過用直徑 90mm 平板；具體過程見步驟 4，這時所加入的噬菌體溶液是第一輪篩選得到的噬菌體上清（見步驟 18），在用前要滴定好噬菌體的滴度，噬菌斑的數(shù)量以可區(qū)分出單個克隆，同時密度不能太稀為標(biāo)準(zhǔn)（一般 100-200 pfu/90mm）。20. 按第一輪相似的過程進(jìn)行實驗，最后顯色，確定真正的陽性克隆，并將陽性單克隆所在的培養(yǎng)基挖出放入 500?l SM buffer 中，并加入 25 ml chloroform，4℃貯存（最多可貯存 6 月 ）。

注意：

封閉液一般可用：5%的脫脂牛奶或 1%的 BSA 溶解在 TBST 溶液中。第一輪篩選用 150mm 的平板；第二輪篩選用 90mm 的平板，一般需要篩選至少 1 x 106 pfu。認(rèn)真做好三個不對稱的標(biāo)記，特別在第二輪挑選陽性克隆時要仔細(xì)將膜與平板吻合好，不能挑錯。

三、單克隆剪切

1.取第二輪篩選得到的陽性克隆貯存液上清。

2.將過夜培養(yǎng)的 XL1-blue MRF’細(xì)菌 2000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘，將細(xì)菌溶解在10mM MgSO4 中，調(diào)整細(xì)菌溶度到 OD600=1.0。

3.在一個 EP 管中加入：200?l XL1-blue MRF’細(xì)菌+250ul phage stock（步驟 1）+1 ul ExAssist helper phage。

4.將以上三種樣品混合，37℃下共同保溫 15 分鐘。

5.將樣品混合物加入到 3 ml LB 培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng) 3-4 小時。

6.將試管放于 65-70℃水浴 20 分鐘，3000 轉(zhuǎn)/分，離心 15 分鐘。

7.將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，已發(fā)生剪切的 phage particles 在上清中（上清可在 4℃下儲存 1-2 月 ）。

8.將 100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37℃保溫 15 分鐘 。

9.取步驟 8 中溶液 5-10 ul 涂于 LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），過夜培養(yǎng) 。

10. 第二天細(xì)菌長出，隨機挑取單克隆接種到 LB-amp 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。

11. 過夜培養(yǎng)細(xì)菌分為三部分：（1）提取質(zhì)粒做雙酶切，鑒定外源基因的大小；（2）送樣品進(jìn)行 DNA 測序（3）加入 30-40%的甘油進(jìn)行保種，分裝成小份儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

附錄:

1SMbuffer(1L):

(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)

2、AP-buffer:

(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ;

100 mM NaCl ;

5 mM MgCl2)

3、10xTBS（1L）：

（0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl）

4、LBBroth（1L）：

（10 g NaCl+10 g of tryptone+5 g of yeast extract）