一、裂解細(xì)胞

1．收集細(xì)胞。將培養(yǎng)瓶置于冰上，倒掉培養(yǎng)基，用PBS 或生理鹽水漂洗兩次，留適量液體于瓶?jī)?nèi)，然后用特制的細(xì)胞刮棒朝一個(gè)方向刮取細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，離心取沉淀，-800C 保存。（收集細(xì)胞要迅 速 ，低溫下進(jìn)行，以減弱蛋白酶的作用）

2．裂解細(xì)胞。采用 RIPA 裂解體系，使用前 40C 預(yù)冷，按 107 個(gè)細(xì)胞加入1.0ml 裂解液，吹打混勻，加入適量的蛋白酶抑制劑（如 cocktail），冰 上放置 3~5 分鐘。

3．超聲處理裂解液。使用探針型超聲進(jìn)行多次適當(dāng)頻率的短促?zèng)_擊，10~20秒/次，重復(fù) 3 次，中間間隔 10~20 秒，冰浴下進(jìn)行。

4．15,000rpm，40C 離心 15min，吸取上清液于另一 Ep 管中，置冰上。上清液用于下一步的預(yù)處理。

二、裂解物的預(yù)處理

使用正常人的血清對(duì)裂解物進(jìn)行預(yù)處理。

1、按 1ml 裂解物加 2?l 對(duì)照血清的比例加入正常人血清。

2、室溫孵育 2~3 小時(shí)，緩慢搖動(dòng)。

三、免疫復(fù)合物的純化

1)用 Dynabeads proteinA 進(jìn)行免疫復(fù)合物的純化。

2)將 Dynabeads proteinA 振蕩混勻，吸取 100?l 磁珠于 Ep 管中，置于磁鐵架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。

3)加 500?l 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 )至 Ep 管，輕柔搓動(dòng)管子約 2~3min，將Ep 管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。

4)重復(fù) 2 步驟兩次。

5)清洗完磁珠后，加 500?l 預(yù)處理后的裂解物，反復(fù)搖動(dòng)管子，室溫下反應(yīng)10~20min。

6)將 Ep 管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，將上清轉(zhuǎn)移至另一 Ep 管中。

7)用 RIPA 裂解液清洗磁珠 3 次。

8)洗脫抗原-抗體復(fù)合物。加 0.1M citrate (pH3.1) 30?l 于 Ep 管中，輕柔搓動(dòng)管子約 2~3min，將 Ep 管置于磁鐵架上，吸取上清于一 Ep 管。

9)重復(fù)步驟 7，將上清收集于同一個(gè) Ep 管洗脫樣品總體積為 60?l，作對(duì)照用。

10) 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后備用。

11) 在步驟 5 留取的上清中加入病人血清（1ml 加 2?l 血清），緩慢搖動(dòng)，室溫孵育 2~3h。

12) 將 Ep 管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。

13) 重復(fù)步驟 6~8。共收集到兩份樣品,對(duì)照與病人的純化免疫復(fù)合物各 60?l。

14) 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后加入柱儲(chǔ)液 100?l,40C 保存。

15) 在樣品中加入 2×SDS 上樣緩沖液并用 1M NaOH 調(diào)節(jié) pH 至使溴酚藍(lán)呈藍(lán)色。

四、1DSDS-PAGE

用免疫沉淀后的樣品可直接進(jìn)行一維凝膠電泳，或者對(duì)磁珠上的蛋白 A 或蛋白 G 進(jìn)行耦聯(lián)劑修飾，洗脫后的樣品可進(jìn)行 Western Blot。

RIPA裂解液：

150mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脫氧膽酸鈉；0.1%SDS；

50mmol/L Tris，（ pH 8.0）