雙向電泳的樣品的制備

樣品制備原則

樣品制備是雙向電泳中最關(guān)鍵的一步，將直接影響 2-DE 結(jié)果好壞。目前并沒有一個通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；2）減少對蛋白質(zhì)的人為修飾；3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。

根據(jù)這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑，如 CHAPS 與 Zwittergent 系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducing agents） ，最常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。當然，也可以選擇性
的加入 Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。

樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合，以達到對樣品蛋白的最大抽提。在對樣品蛋白質(zhì)提取的過程中，必須考慮到去除影響蛋白質(zhì)可溶性和 2DE 重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓，甚至會損壞 IPG 膠條，這樣都會造成 2-DE 的失敗。樣品制備的失敗很難通過后續(xù)工作的完善或改進獲得補償。核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應(yīng)控制好條件，并防止產(chǎn)生泡沫；而加入的外源核酸酶則會出現(xiàn)在最終的 2D 膠上。脂類和多糖都可以通過超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時間太長；也可以采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會造成蛋白質(zhì)的部分損失。因此，樣品制備方法必須根據(jù)不同的樣品、所處的狀態(tài)以及實驗?zāi)康暮鸵髞磉M行選擇。目前有很多方法適于 2-DE，如組織或細胞的總蛋白提取物、亞細胞組份或細胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、采用親合純化凝集素結(jié)合蛋白等）。

一、細胞樣品

1.細胞培養(yǎng)，加藥與處理。

2.胰酶消化貼壁細胞，PBS 漂洗 3 次(1500ｇ，5min)，棄上清, 再次離心，去盡殘液（非常重要！）。如要比較細胞膜蛋白組的差別，最好用細胞刮收獲細胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS，可有效降低樣品的鹽濃度。加入 5 倍體積裂解液，混勻（或?qū)?1×106 細胞懸于 60～100?l 裂解液中）。

3.加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase，在 4℃放置 15 分鐘。

4.15,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 30 分鐘）。

5.收集上清。

6.測定蛋白濃度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit)。

7.分裝樣品，凍存于－70℃。

二、組織樣品

1.碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。

2. 將適量粉末狀組織轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入適量裂解液，進行勻漿。

3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在 4℃放置 15 分鐘。

4. 15,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn)，4℃離心 30 分鐘）。

5. 收集上清，測定蛋白濃度。

6.分裝樣品，凍存于－70℃。

注意事項：

1.8 mmol/L PMSF 必須在添加還原劑之前用，否則 PMSF 會失去活性。

2. 40 mmol/L 濃度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3. 細胞清洗――大多用 PBS，若 PBS 殘留于細胞表面會造成膠上出現(xiàn)水平條紋 ，則可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此問題。

雙向電泳操作步驟

水化上樣(被動上樣)

1.從冰箱中取出 IPG 膠條，室溫放置 10min。

2.沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各 1cm 左右不加樣，中間的樣品液一定要連貫.注意：

注意：

不要產(chǎn)生氣泡，否則會影響膠條中蛋白質(zhì)的分布。

3.用鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的保護層。

注意：

堿性端較脆弱，應(yīng)小心操作。

4.將IPG 膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上

注意:

不要將樣品溶液弄到膠條背面,因為這些溶液不會被膠條吸收;還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如產(chǎn)生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕走。

5.放置 30~45min 大部分樣品被膠條吸收，沿著膠條緩慢加入礦物油，每根膠條約 3ml(17cm IPG)，防止膠條水化過程中液體蒸發(fā)。

6.置等電聚焦儀于-20℃水化 11~15h。

第一向等電聚焦

1.將紙電極置于聚焦盤的正負極上，加 ddH2O 5~8?l 潤濕。

2.取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干，膠面朝下，將其置于剛好潤濕的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。

3.將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中，膠條的正極（標有+）對應(yīng)于聚焦盤的正極，確保膠條與電極緊密接觸。

4.在每根膠條上覆蓋 2-3ml 礦物油。

5.對好正、負極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。

6.聚焦結(jié)束的膠條，立即進行平衡、第二向 SDS-PAGE 電泳。或?qū)⒛z條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存，電泳前取出膠條，室溫放置 10 分鐘，使其溶解 。

第二向SDS-PAGE

電泳

1.配制 12%的丙烯酰胺凝膠。

2.待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的 MilliQ 水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。

3.配制膠條平衡緩沖液 I

4.在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用 MilliQ 水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品，這樣可以減少凝膠染色時出現(xiàn)的縱條紋。

5.將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤中，加入 6ml(17cm IPG)平衡緩沖液 I，在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘。

6.配制膠條平衡緩沖液 II。

7.第一次平衡結(jié)束后，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體，放入平衡緩沖液 II 中，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘。

8.用濾紙吸去 SDS-PAGE 膠上方玻璃板間多余的液體，將二向凝膠放在桌面上，凝膠的頂部面對自己。

9.將瓊脂糖封膠液加熱溶解。

10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液。

11. 第二次平衡結(jié)束后，取出膠條，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

12. 用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在 1×電泳緩沖液中漂洗數(shù)次。

13. 將膠條背面朝向玻璃板，輕輕放在長玻板上，加入低熔點瓊脂糖封膠液。

14. 用適當厚度的膠片,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸.

注意:

不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡，應(yīng)推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面 。

15. 放置 5 分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固。

16. 打開二向電泳制冷儀，調(diào)溫度為 15℃。

17. 將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通電源，起始時用的低電流（5mA~10mA/gel/17cm），待樣品在完全走出 IPG 膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（20-30mA/gel/17cm）待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳 。

18. 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。

19. 進行染色。