Argonaute蛋白在進(jìn)化過程中演變出了各種亞科蛋白。這些亞科蛋白可以識別各種不同類型的小RNA分子，從而在各種小RNA沉默途徑中發(fā)揮作用。在經(jīng)典的由siRNA分子介導(dǎo)的RNAi途徑中，Argonaute蛋白可以用內(nèi)切核酸酶活性來沉默mRNA靶分子，這種過程被稱作切割。在生殖細(xì)胞中，面對各種外來的遺傳物質(zhì)，Argonaute亞科蛋白PIWI蛋白在piRNA介導(dǎo)的RNA沉默途徑中，利用的也是切割機(jī)制。

在真核生物Ago (eAgo)蛋白，Argonaute (Ago)蛋白可以結(jié)合非編碼的小RNA，參與降解或者抑制互補(bǔ)配對的靶向RNA，從而影響基因表達(dá)，稱之為RNA干擾 (RNAi)【2】。揭示RNA干擾機(jī)理的兩位美國科學(xué)家獲得了2006年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。所有的eAgo都具有非常保守的結(jié)構(gòu)功能域，主要由N-結(jié)構(gòu)域（結(jié)合與分離靶向鏈），PAZ結(jié)構(gòu)域（結(jié)合引導(dǎo)鏈的3’末端），MID結(jié)構(gòu)域（結(jié)合引導(dǎo)鏈的5’末端）和PIWI結(jié)構(gòu)域（核酸酶催化中心所在）組成。

細(xì)菌Ago（pAgo）蛋白主要分為長pAgo和短pAgo蛋白。其中，研究較多的長pAgo結(jié)構(gòu)域和eAgo結(jié)構(gòu)域非常相似，主要使用RNA或者DNA作為靶向序列參與清除入侵的核酸（噬菌體或質(zhì)粒）或解除基因組連接。而占已知pAgo大多數(shù)的短pAgo的研究較少。短pAgo只編碼MID結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域，并且其PIWI結(jié)構(gòu)域沒有核酸酶催化中心，不能降解結(jié)合的核酸。但是短pAgo通常與一個伴侶蛋白形成異源復(fù)合物發(fā)揮功能。長久以來，細(xì)菌中的短pAgo（約占Ago家族58%）如何發(fā)揮作用以及怎么發(fā)揮作用是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的重大問題【3】。

這一領(lǐng)域的第一個突破性發(fā)現(xiàn)來自荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的Daan C. Swarts團(tuán)隊(duì)。2022年，他們研究了一種短pAgo與伴侶蛋白（TIR-APAZ）組成的異源二聚系統(tǒng)MapSPARTA。當(dāng)細(xì)菌遭受外源質(zhì)粒侵襲后，MapSPARTA被激活，在單鏈RNA引導(dǎo)下結(jié)合靶向單鏈DNA后，MapSPARTA可以形成四聚體，從而激活伴侶蛋白中的TIR結(jié)構(gòu)域的NAD(P)+酶活性，進(jìn)而消耗細(xì)菌體內(nèi)的NAD(P)+。因?yàn)镹ADP是維持細(xì)菌生存必需的小分子，NADP的耗竭將會導(dǎo)致細(xì)菌死亡。這樣，通過犧牲侵染細(xì)菌個體達(dá)到保護(hù)群體的效果【4】。Swarts團(tuán)隊(duì)的發(fā)現(xiàn)未能揭示MapSPARTA的結(jié)構(gòu)和活化機(jī)理。

2023年7月26日，來自俄亥俄州立大學(xué)的傅天民團(tuán)隊(duì)，在Nature以加速出版形式發(fā)表論文Oligomerization-mediated activation of a short prokaryotic Argonaute，他們利用冷凍電鏡和生物化學(xué)手段，完整揭示了的MapSPARTA活化機(jī)理。

在文中，作者捕捉到一系列高分辨率的MapSPARTA構(gòu)象，包括未激活狀態(tài)下的MapSPARTA單體結(jié)構(gòu)，結(jié)合引導(dǎo)RNA鏈和靶向DNA鏈后的單體結(jié)構(gòu)，MapSPARTA二聚化的中間態(tài)結(jié)構(gòu)，四聚化的活化態(tài)的MapSPARTA，以及四聚體與NAD+的復(fù)合物，完整呈現(xiàn)了MapSPARTA獨(dú)特的層級激活分子機(jī)制。鑒于Ago蛋白在眾多生物體中的廣泛存在，研究清楚MapSPARTA的作用機(jī)制，不僅有助于理解短pAgo的生物學(xué)功能和分子作用機(jī)制，也為改造pAgo奠定了基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：

1)解析了分辨率為3.1 ?的未激活狀態(tài)下的MapSPARTA單體結(jié)構(gòu)，闡明了單體的基本結(jié)構(gòu)組成，以及各個結(jié)構(gòu)域的相互作用。

2)與其他Ago相比，MapSPARTA獨(dú)特的APAZ結(jié)構(gòu)域有一個C末端基序，這個C末端基序占據(jù)核酸結(jié)合口袋，起到抑制了核酸結(jié)合的功能。

3)闡明了MapSPARTA識別RNA引導(dǎo)鏈和DNA靶向鏈的分子基礎(chǔ)。與其他Ago相比，短的pAgoMID結(jié)構(gòu)域中特別存在的兩個Loop，導(dǎo)致RNA引導(dǎo)鏈和DNA靶向鏈從第三位才開始互補(bǔ)配對。

4)解析了分辨率為2.7 ?的活化狀態(tài)下的四聚體MapSPARTA結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)像一個美麗的蝴蝶。四聚體中存在兩類相互作用：一類通過兩個MID-MID結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)；另一類則是通過4個TIR結(jié)構(gòu)域形成聚集體來實(shí)現(xiàn)的。四個MapSPARTA形成一個不對稱的四聚體。四個SPARTA分子有兩種不同的狀態(tài)，兩種狀態(tài)下的TIR結(jié)構(gòu)域有大約180度的翻轉(zhuǎn)。

5)TIR四聚體中有兩種相互作用界面：二聚化作用界面和四聚化作用界面。TIR結(jié)構(gòu)域可以催化NAD降解，研究表明NAD+分子結(jié)合在TIR結(jié)構(gòu)域兩個二聚化作用界面上。進(jìn)一步生化分析發(fā)現(xiàn)四聚體對于TIR的催化是必要的。

6)本文捕捉到了MapSPARTA未激活結(jié)構(gòu)，結(jié)合核酸的單體結(jié)構(gòu)，結(jié)合核酸的二聚體結(jié)構(gòu)， 以及活化的四聚體結(jié)構(gòu)，這一系列結(jié)構(gòu)揭示了MapSPARTA的層級激活機(jī)理。未激活狀態(tài)下的MapSPARTA單體結(jié)合RNA引導(dǎo)鏈/DNA靶向鏈后，MID結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化。接著，兩個結(jié)合互補(bǔ)核酸鏈的MapSPARTA單體相互靠近后，由于MID形狀和電荷的互補(bǔ)，MID結(jié)構(gòu)域和另一個MID結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，形成一個對稱的二聚體。在對稱二聚體中，APAZ連接的TIR結(jié)構(gòu)域由于電荷和形狀的互斥反應(yīng)，其中一個TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生近約180度的翻轉(zhuǎn)，形成不對稱二聚體。最后兩個不對稱二聚化的MapSPARTA再通過TIR相互作用變?yōu)樗木刍せ顮顟B(tài)。

圖1. MapSPARTA的圖示激活過程

綜上，本研究首次從分子水平上描述了短pAgo家族MapSPARTA的激活機(jī)制，為理解其他短Ago活化機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步改造MapSPARTA成為核酸檢測或治療工具提供了理論支持。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06456-z

參考文獻(xiàn)：

1.Swarts, D. C. et al. The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nat Struct Mol Biol 21, 743-753, doi:10.1038/nsmb.2879 (2014).

2.Peters, L. & Meister, G. Argonaute proteins: mediators of RNA silencing. Mol Cell 26, 611-623, doi:10.1016/j.molcel.2007.05.001 (2007).

3.Lisitskaya, L., Aravin, A. A. & Kulbachinskiy, A. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins. Nat Commun 9, 5165, doi:10.1038/s41467-018-07449-7 (2018).

4.Koopal, B. et al. Short prokaryotic Argonaute systems trigger cell death upon detection of invading DNA. Cell 185, 1471-1486 e1419, doi:10.1016/j.cell.2022.03.012 (2022).