聚（乙二醇）（PEG）是藥物遞送系統(tǒng)中廣泛使用的聚合物，并且通常直接與藥物治療劑綴合。PEG是一種水溶性、生物惰性、非免疫原性合成聚合物，由乙二醇（-CH 2-CH 2-O-）重復(fù)單元組成（圖1）。PEG是通過環(huán)氧乙烷的陰離子聚合反應(yīng)產(chǎn)生的，該聚合反應(yīng)由甲氧基離子對環(huán)氧環(huán)的親核攻擊引發(fā)（圖2）。蛋白質(zhì)綴合物的PEG化是PEG非共價或共價連接至潛在的感興趣的蛋白質(zhì)、肽或抗體以在諸如構(gòu)象、靜電結(jié)合和疏水性的領(lǐng)域中產(chǎn)生大分子的理化性質(zhì)的改變的過程。聚乙二醇化被用作一種策略，以克服預(yù)期用于治療用途的候選藥物的不穩(wěn)定性、循環(huán)半衰期不足和免疫原性等挑戰(zhàn)。

圖1：單個PEG鏈的結(jié)構(gòu)。	圖2：通過陰離子聚合合成mPEG的機(jī)理

PEG化前的注意事項

PEG聚合物的結(jié)構(gòu)和大小是在蛋白質(zhì)PEG化之前考慮的重要參數(shù)。發(fā)現(xiàn)結(jié)合的PEG的質(zhì)量對于確定其在血液中保留的時間是重要的。 PEG性質(zhì)的現(xiàn)代改進(jìn)涉及合成較少多分散的PEG產(chǎn)物，例如支鏈形式。最初，幾年來使用的唯一PEG聚合物的大小為5 kDa，其在鏈的一部分處用甲氧基“封端”并在羥基處終止。然而，將蛋白質(zhì)與這些聚合物綴合存在缺陷。一方面，這導(dǎo)致樣品中存在顯著量的二醇雜質(zhì)，這導(dǎo)致形成共價蛋白質(zhì)聚集體。另一方面，PEG聚合物內(nèi)存在不同長度的側(cè)鏈（高多分散性），這導(dǎo)致具有不同質(zhì)量的綴合物產(chǎn)物。兩者都在最終的聚乙二醇化蛋白質(zhì)產(chǎn)物中產(chǎn)生異質(zhì)性。為了克服這一點，在20世紀(jì)90年代，低多分散、活化、高質(zhì)量支化PEG聚合物（尺寸為30- 40 kDa）進(jìn)入市場。支鏈PEG（PEG 2）的特征在于兩條PEG聚合物鏈連接到一個活化部分。這種聚合物形式通過允許通過修飾蛋白質(zhì)中的一個氨基酸殘基來連接雙重聚合物，從而允許蛋白質(zhì)表面的更高掩蔽，使蛋白質(zhì)更具生物活性。 考慮到掩蔽蛋白質(zhì)中的催化或識別位點的可能性很高，因此有必要優(yōu)化連接鏈的數(shù)量和質(zhì)量（修飾程度），以保持最大的生物活性和生物利用度。因此，PEG端基的疏水性是一個考慮因素。 謝爾曼等人，使用抗PEG抗體檢測三種不同PEG類似物，叔丁氧基-PEG（tBu-PEG）、甲氧基-PEG（mPEG）和羥基-PEG（OH-PEG）的免疫原性的研究發(fā)現(xiàn)，在“端帽”處的體積越大（分子量越高）、疏水性越強(qiáng)，非免疫原性特征越大。相比之下，OH-PEG被認(rèn)為對于PEG化的治療劑更好，因為更大的側(cè)鏈可能導(dǎo)致增加的屏蔽。

蛋白質(zhì)PEG化之前的另一個重要參數(shù)是蛋白質(zhì)序列內(nèi)的靶向綴合。不幸的是，只有少數(shù)策略用于位點特異性綴合，例如在低pH下綴合至蛋白質(zhì)的氨基末端基團(tuán)。在氨基基團(tuán)處的PEG-聚合物綴合通過烷基化或酰化發(fā)生。烷基化保持帶正電荷的胺，而酰化產(chǎn)生中性酰胺，其可改變蛋白質(zhì)的表面特征，這可降低蛋白質(zhì)綴合物的生物利用度和活性。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在賴氨酸的ε-氨基處，其具有比蛋白質(zhì)α-氨基末端更高的酸解離常數(shù)（pKA），為更優(yōu)先的位點特異性綴合讓路，因為在低pH下，α-氨基僅具有反應(yīng)性。

蛋白質(zhì)與PEG結(jié)合的優(yōu)勢

將PEG連接到生物大分子的關(guān)鍵優(yōu)點是：沿著PEG的1）在水溶液和有機(jī)溶液中的高溶解度，2）其親水特性、3）其非免疫原性特性。PEG的重復(fù)側(cè)鏈單元與蛋白質(zhì)連接，使得它們可以在空間上屏蔽抗原表位免受免疫系統(tǒng)識別，因為PEG是非免疫原性聚合物。這可以幫助治療性綴合物避免通過來自網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬反應(yīng)或蛋白水解酶的降解，所述蛋白水解酶試圖去除循環(huán)和組織中的外來顆粒或可溶性物質(zhì)。蛋白質(zhì)與PEG的綴合可以通過PEG側(cè)鏈與水分子提供的氫鍵增加親水性，這增加了流體動力學(xué)體積并產(chǎn)生了圍繞聚合物的穩(wěn)定的水合殼，這可以通過結(jié)果增加結(jié)合的大分子的溶解度。這種流體動力學(xué)尺寸的增加有助于在腎臟中產(chǎn)生對腎過濾的阻力，導(dǎo)致藥物綴合物的清除發(fā)生得更慢。

Enzo該試劑盒適用于藥物開發(fā)和制藥應(yīng)用，包括藥物配方、藥代動力學(xué)分析、藥物比較、候選藥物鑒別、批放行標(biāo)準(zhǔn)和過程中QC研究。該試劑盒也已被驗證用于定量復(fù)雜生物基質(zhì)中的聚乙二醇化靶分子，擴(kuò)展了其用于監(jiān)測藥物水平或其在組織中積累的實用性。該測定法可測量1 ng/ml的PEG化分子，并對各種分子量的線性和支化PEG（游離形式和蛋白質(zhì)結(jié)合物）進(jìn)行了驗證（圖3）。該試劑盒能夠在2小時內(nèi)一式兩份分析多達(dá)35個樣品，適合快速、高通量分析。通過在單次試驗中測定兩種含PEG-BSA的緩沖液對照品的16份重復(fù)樣品，確定試驗內(nèi)精密度。圖4顯示，在開發(fā)過程中，該ELISA報告了3.4 - 4.2%的低試驗內(nèi)%CV范圍。另一方面，通過反算幾天內(nèi)多次試驗中產(chǎn)生的16條標(biāo)準(zhǔn)曲線中的3份標(biāo)準(zhǔn)品，確定試驗間精密度。圖5顯示，在產(chǎn)品開發(fā)中，該ELISA報告了1.3 - 5.7%之間的低試驗間%CV范圍。聚乙二醇化ELISA試劑盒是一種具有高標(biāo)準(zhǔn)重現(xiàn)性的高精度試劑盒。

圖3：PEG化蛋白ELISA試劑盒的特異性。	圖4：PEG化蛋白ELISA試劑盒的試驗內(nèi)精密度。	圖5：PEG化蛋白ELISA試劑盒的試驗間精密度。

用PEG綴合蛋白質(zhì)的缺點

PEG是最常用的聚合物，并且用作將PEG綴合至藥物候選物的基于聚合物的藥物遞送系統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)作為藥物候選物的潛在化學(xué)先導(dǎo)物的PEG化是期望的，因為它增加了保留時間，降低了免疫原性并增加了待被酶代謝的藥物的穩(wěn)定性。已從代謝的聚乙二醇化治療劑在各種組織中的積累中發(fā)現(xiàn)了可能的副作用和并發(fā)癥，因此聚乙二醇化產(chǎn)物的影響的檢查一直是表征超敏反應(yīng)、藥代動力學(xué)行為的意外變化、毒性和來自它們的機(jī)械應(yīng)力降解的拮抗作用的焦點。測定PEG化取代基的濃度可以是藥物開發(fā)應(yīng)用的有用工具，例如藥代動力學(xué)分析、藥物比較、先導(dǎo)候選物鑒定、批放行標(biāo)準(zhǔn)和過程中QC研究。

圖6：我們的PEG化蛋白ELISA試劑盒的靈敏度。

除了Enzo的PEG化ELISA試劑盒提供的高重現(xiàn)性外，它還提供了一種高靈敏度的免疫測定法，檢測限小于1 ng/ml，動態(tài)范圍為1.75 ng/ml至225 ng/ml。該測定的靈敏度取決于檢測的PEG的分子量和與靶分子綴合的PEG分子的量，并使用相對于BSA以1、3、5、10和15倍摩爾過量提供的10 kDa線性PEG評價制備的綴合物（圖6）。